颞叶癫痫小鼠外周血细胞因子mRNA水平变化☆

周媛金立德赵敏曹霞钱希颖

颞叶癫痫小鼠外周血细胞因子mRNA水平变化☆

周媛*金立德△赵敏※曹霞*钱希颖△

目的研究颞叶癫痫小鼠发作2 h外周血IFN-α6、IFN-γ、IL-1β以及TNFR-m18等细胞因子变化情况。方法采用real-time PCR法检测癫痫发作后10 min、30 min、1 h和2 h癫痫小鼠外周血中IFN-α6、IFN-γ、IL-1β以及TNFR-m18 mRNA的表达。结果 癫痫组30 min时IL-1β mRNA的表达水平与对照组及SE10 min比较均升高（P＜0.05）；癫痫组10 min时IFN-α6 mRNA表达水平低于对照组（P＜0.05）；IFN-γ mRNA表达水平在SE10 min时与对照组及SE其他时间点相比有统计学差异（P＜0.05）；TNFR-m18 mRNA表达水平在SE 1 h时与对照组及SE其他时间点（10 min、30 min、2 h）相比升高（P＜0.01）。结论癫痫状态下外周血中细胞因子mRNA表达水平失衡，可能与急性期癫痫的免疫病理过程有关。

癫痫 外周血 细胞因子

【Abstract】Objective To study the expression changes of IL-1β、FN-α6、IFN-γ and TNFR-m18 in peripheral blood within 2 hours in epileptic mice.Methods Semi quantitative real-time PCR was used to test the mRNA expression level of IL-1β、FN-α6、IFN-γ and TNFR-m18 in peripheral blood from normal and pilocarpine-induced epileptic mice at different time points（10 min，30 min，1 h and 2 h）.Results The mRNA expression level of IL-1β increased at 30 min（1.8±0.07），1 h（2.9±0.98）and 2 h（1.45±0.11）after pilocarpine-induced status epilepticus comparing with that of control and SE 10 min（0.81±0.09）（P＜0.05）.The IFN-α6 mRNA expression level was lower at 10 min（0.59±0.05，P＜0.05）than that of control.IFN-γ mRNA expression level was higher at 10 min（2.85±0.11）than that of control and at other time points during SE（P＜0.01）.TNFR-m18 mRNA expression level was higher at 1h（2.84±0.15）than that of control，and at other time points during SE（P＜0.01）.Conclusion The immune system of epileptic state is active，the imbalance of cytokine expression in peripheral blood may be related to the immune pathological process of acute stage of epilepsy.

【Key Words】Epilepsy Peripheral blood Cytokines

颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE）病灶起源于颞叶（被认为主要是海马结构），以反复痫性发作为特征，其发生机制至今尚未完全明确。在中枢神经系统网络中，免疫系统能通过产生多种免疫活性物质调节神经功能［1］，参与神经免疫调节和炎性反应过程，细胞因子的异常表达与癫痫发生及神经细胞损伤间存在密切联系［2］。腹腔内反复注射致痫剂量的胆碱能受体激动剂毛果芸香碱（Pilocarpine）能引起癫痫持续状态的发生，原因可能与脑内神经病理性损伤有关［3-5］。本实验探索了TLE小鼠急性期不同时间点外周血IFN-α6、IFN-γ、IL-1β及TNFR-m18细胞因子mRNA的改变及其与TLE进展的相关性，为TLE的诊断和治疗提供新的思路。

1　动物与方法

1.1实验动物昆明小鼠60只由昆明医学院实验动物中心提供，诱导用昆明小鼠的年龄控制在2个月左右（60±5 d），体质量20～25 g，雌雄不限。小鼠在毛果芸香碱诱导癫痫发作后不同时间点（10 min，30 min，1 h，2 h）被处死，采集小鼠外周血备用。

1.2方法

1.2.1癫痫小鼠模型的建立及外周血采集 诱导前30 min，按1 mg/kg腹部皮下注射硝酸甲基东莨菪碱，随后按体质量300 mg/kg腹腔注射毛果芸香碱（Sigma，美国）。对照组给予腹腔注射生理盐水0.1 mL，诱发癫痫成功后，按发作后10 min、30 min、1 h、2 h分组，每组6只，相同时间点设对照组。取实验组及对照组小鼠外周血用于IL-1β、FN-α6、IFN-γ和TNFR-m18 mRNA半定量检测。

1.2.2 Real-time PCR检测各细胞因子mRNA表达量 将采集到的外周血按照mRNA提取试剂盒RNeay@Mini kit、RT-PCR试剂盒（Qiagen，美国）说明书提取外周全血mRNA，利用RT-PCR试剂盒对每个样品RNA（2 μg）进行逆转录获得cDNA，置于-20℃备用。采用SYBR绿色DNA结合染料（The SYBR Green I double-stranded DNA binding dye）（Roche，德国）行实时定量PCR检测，以β-actin作为实验组及对照组待检基因的内参基因。待检细胞因子及内参基因引物序列如下：IFN-α6：上游引物5’-TGGCAAGACTGAATGAGGACGA-3’，下游引物5’-AGCGTCTTGGCAGGTTGATTGT-3’；IFN-γ：上游引物5’-CCTGGTCTCCGATCCTACCAT-3’，下 游 引物 5’-TTGCAGGTGGTTGTGCCTT-3’；IL-1β：上游 引 物 5’-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3’，下 游 引 物 5’-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3’；TNFR-m18：上游引物5’-CAAGGGGATATTGTGTTTGGCT-3’，下游引物5’-GATGACAGTCAAATGGCCGTA-3’；β-actin：上游引物5’-TGAACCCTAAGGCCAACCGTG-3’，下游引物5’-GCTCATAGCTCTTCTCCAGGG-3’，每个样本做3个复孔。反应体系如下：SYBR Green I mix 4 μL，cDNA模板5 μL，上下引物（10 μM）2 μL，SYBR Green水9 μL，体积共计为20 μL。在LightCycler实时荧光定量PCR仪中进行反应。反应条件为：95℃预变性10 min；94℃变性1 s，60℃退火6 s，72℃延伸10 s，循环数为45个循环；最后冷却至40℃。用2-△△Ct法分析各细胞因子在癫痫发作后的相对量。

1.3.统计学方法 用Graphpad Prism 4.0软件进行结果的统计学分析，各细胞因子表达水平用（x± s）表示，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1癫痫动物模型的建立 小鼠在毛果芸香碱诱导后（25.8±15.6）min进入癫痫持续状态，对照组未见癫痫发作。

2.2癫痫急性期外周血各细胞因子mRNA表达

2.2.1IL-1β表达水平 与对照组及癫痫组SE 10 min比较，癫痫组SE 30 min、1 h及2 h时IL-1β表达水平均升高（P值均小于0.05），但SE 30 min、1 h及2 h时之间两两比较无统计学差异（P＞0.05）。

2.2.2 IFN-α6表达水平 IFN-α6表达水平在癫痫组SE 10 min时与对照组比较下降（P=0.031），SE其他时间点与SE 10 min时及对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.2.3 IFN-γ表达水平 IFN-γ表达水平在SE 10 min时与对照组比较明显升高（P=0.0043），与SE其他时间点（30 min，1 h，2 h）相比均升高，并都具有统计学差异（P值均小于0.01）。SE其他时间点（30 min，1 h，2 h）与对照组之间，以及各时间点之间两两比较均无统计学意义（P＞0.05）。

2.2.4 TNFR-m18表达水平 TNFR-m18表达水平在SE 1 h时与对照组、与SE 10 min、SE 30 min、SE 2 h时比较均明显升高（P值均小于0.01）；TNFR-m18表达水平在SE 10 min、SE 30 min、SE 2 h时与对照组比较，以及各时间点之间两两比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3　讨论

表1癫痫急性期外周血各细胞因子mRNA表达变化

研究表明癫痫发生后外周血单个核细胞活化并产生多种细胞因子，探索不同细胞因子表达变化与癫痫发作的关系对早期诊断癫痫有一定的指导意义。

研究表明IL-1β可通过多种途径参与癫痫的发生发展过程。研究发现癫痫患者外周血和脑脊液中IL-1β水平增高，IL-1RA/IL-1β降低［6-10］。癫痫患儿外周血及脑脊液中细胞因子IFN、TNF、IL-1水平增高，可促进癫痫的发生发展［4-6］。动物试验发现IL-lβ和TNF-α等细胞因子存在于癫痫产生及播散的脑区中，在癫痫急性发作及慢性病程中均有过度表达［5］。本研究小鼠癫痫发作后30 min、1 h、2 h时IL-1βmRNA都较对照组升高（P＜0.05），说明IL-1β在癫痫早期即参与了癫痫的发作过程。

研究发现IFN、TNF和IL-2等对癫痫的发生发展也具有促进作用。如研究显示IFN-α在中枢神经系统内对海马CA3锥体细胞产生兴奋性影响，并能减弱抑制性突触后电位活动，最终导致癫痫样放电；IFN-α能与TNF-α协同作用，促进IL-2产生及IL-2R的表达；IFN-γ能增强血-脑脊液屏障的通透性并促进癫痫的进展［11］。IFN-γ也可促进海马CA3区锥体细胞的病样放电，减少突触前抑制，降低GABA的合成或锥体细胞对GABA的突触敏感性，从而导致癫痫发作和血-脑脊液屏障损伤。本研究拟探索毛果芸香碱诱发癫痫发病后早期（10 min～2 h）细胞因子的变化情况，由于核酸表达早于蛋白质，能灵敏反应细胞因子表达变化水平，故本研究选择检测相应细胞因子的mRNA水平。研究发现癫痫发作10 min时IFN-γmRNA表达明显升高（P＜0.05），但30 min、1 h与2 h时表达水平与对照组无差别。ARZT ES等［10］曾报道毛果芸香碱能够抑制植物血凝素（PHA）诱导的外周血单核细胞合成IFN-γ，本实验采用的是外周全血RNA，包括了外周血单核细胞，还有其他白细胞如T淋巴细胞、中性粒细胞等，我们的研究结果表明，在毛果芸香碱诱导颞叶癫痫小鼠发作2 h内，外周血中的IFN-γmRNA表达水平明显升高，这说明在癫痫发作病理情况下，毛果芸香碱对外周血单核细胞IFN-γmRNA的抑制作用并不明显，IFN-γ的异常表达极有可能参与了癫痫发作的后续过程。

SHINODA等［12］用海人酸（kainicacid，KA）诱导大鼠癫痫模型，发现癫痫发作后4～24 h海马中TNFRⅠ的表达有明显升高；THOMPSON等［13］也发现癫痫小鼠SE后24～72 h海马TNFRⅠ表达才出现增加。本研究中TNFR-m18在SE 1 h时表达水平也较对照组明显升高（P＜0.05），表明TNFR-m18在癫痫发病中较TNFRⅠ更早出现表达的异常，推测它可能与TNFRⅠ一样参与了癫痫的发病过程。

综上所述，在颞叶癫痫发作的急性期，外周血中多种细胞因子如IL-1β、IFN-γ、IFN-α6及TNFR-m18核酸的表达都出现明显变化，提示在TLE发作期的发生发展过程中，外周血免疫出现紊乱且可能对癫痫的后续病变有一定的影响，在癫痫发作早期这些细胞因子的蛋白表达是否与核酸变化水平一致尚需进一步研究。

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（责任编辑：李立）

Cytokines expression and significance in the peripheral blood from mice with temporal lobe epileptic in the acute phase.

ZHOU Yuan，JIN Lide，ZHAO Min，CAO Xia，QIAN Xiying.Department of Central Laboratry，The 2nd Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650101，China.Tel：0871-63402209.

R742

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.01.003
☆国家自然科学地区基金（编号：31160206）；云南省联合专项基金（编号：2013FB150）
*昆明医科大学第二附属医院中心实验室（昆明 650101）△云南省第一人民医院神经外科
※昆明医科大学人体解剖学与组织胚胎学教研室

（E-mail：1244815508@qq.com）

2015-05-04）