缺氧诱导因子1α调控claudin-1蛋白表达对肠道粘膜屏障功能的影响

徐卫华，高胜东

孝昌县第一人民医院消化内科(湖北 孝昌 432900)



缺氧诱导因子1α调控claudin-1蛋白表达对肠道粘膜屏障功能的影响

徐卫华，高胜东

孝昌县第一人民医院消化内科(湖北 孝昌 432900)

目的观察缺氧诱导因子1α(HIF1α)对紧密连接蛋白claudin-1及肠道屏障功能的影响。方法在常氧和缺氧条件下培养大鼠小肠上皮细胞系IEC-6细胞，Elisa法检测HIF1α的分泌，RT-PCR及免疫印迹法观察claudin mRNA和蛋白表达，肠上皮细胞跨上皮电阻检测通透性。结果与常氧组比较，缺氧可明显增加HIF1α分泌，减少claudin-1蛋白表达，减小跨上皮电阻(P<0.01；P<0.001)。以重组HIF1α处理常氧状态下IEC-6细胞24～72 h，可明显抑制claudin-1的mRNA表达(P<0.01；P<0.001)。结论缺氧状态下IEC-6细胞分泌HIF1α增多，抑制claudin-1表达，进而增强肠上皮细胞通透性，导致屏障功能受损。

缺氧诱导因子1α；Claudin-1；缺氧；肠道屏障功能

【Abstract】Objective To observe the effects of Human hypoxia-inducible factor 1α (HIF1α) on claudin-1 expression and intestinal epithelial barrier function.Methods Intestinal epithelial cell line IEC-6 was cultured under the condition of normal oxygen and hypoxia. HIF1α secretion from IEC-6 was measured by Elisa and the expression of claudin-1 mRNA and protein was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction and western blot,respectively.Transepithelial electrical resistance was measured by resistance test instrument.Results Compared with the normoxia group,HIF1α secretion significantly increased in the hypoxia group and suppressed claudin-1 protein expression.Moreover,transepithelial electrical resistance was also reduced under hypoxia.IEC-6 cells under normoxia condition with recombinant HIF1α suppressed claudin-1 mRNA expression.Conclusions Under the hypoxia condition, HIF1α was increasingly secreted from IEC-6 cells and it suppressed claudin-1 expression,which in turn enhanced intestinal permeability and resulted in intestinal epithelial barrier dysfunction.

【Key words】Human hypoxia-inducible factor 1α;Claudin-1;hypoxia；intestinal epithelial barrier function

肠黏膜机械屏障主要由紧密连接(tight junction，TJ)这一结构组成，为选择性屏障，可阻止大多数亲水性溶质透过[1]。TJ主要由相关蛋白复合物组成，成员包括claudin、 occludin家族、ZO(zonula occludens)家族、连接黏附分子等，其中最主要的结构蛋白为claudin-1[2]。大量研究表明，肠黏膜屏障功能调控与局部缺氧关系密切。缺氧可导致缺氧诱导因子1α(HIF1α)稳定表达[3]。然而HIF1α是否参与调控claudin-1表达，进而影响肠黏膜屏障功能尚不清楚。本研究通过体外细胞实验观察HIF1α在缺氧条件下对claudin-1表达以及肠上皮屏障功能的调控作用。

1　材料与方法

1.1主要试剂及仪器大鼠小肠上皮细胞系 IEC-6细胞购自中国科学院细胞库；HIF1α购自艾美捷科技有限公司；HIF1α ELISA试剂盒购自R&D Systems中国分公司；胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Sigma 公司；抗大鼠闭合蛋白(claudin-1)购自美国Abcam公司；Transwell小室、Millicell ERS-2电阻测定仪、化学发光检测试剂盒、PVDF膜均购自美国Millipore公司；电泳仪、垂直电泳仪购自美国 BioRad公司；Trizol，RT-PCR引物及RT-PCR相关试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2IEC-6的培养与分组IEC-6细胞在 37℃、5% CO2饱和湿度的条件下用含10% 胎牛血清及100 U/L胰岛素的DMEM高糖培养基培养。细胞培养至90%以上融合后分为常氧组(21%氧浓度)培养24 h、缺氧组(2%氧浓度)培养4 h后，改用常氧继续培养20 h。

1.3Elisa法检测HIF 1α采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)方法，参照试剂盒说明书进行，于酶标仪上测定450 nm处的吸光度值。每孔设3个复孔，取平均值。

1.4RNA的提取及RT-PCR检测IEC-6细胞以 6×105密度每孔接种于6孔板中，培养至90%以上融合后施加HIF1α处理24 h。之后以预冷PBS漂洗细胞，每孔加入1 mL Trizol，按说明书步骤提取总RNA并定量后，取1 μg按照 Primescript逆转录试剂盒进行逆转录 (20 μL体系)，合成cDNA。RT-PCR扩增条件：95℃ 5 min，94℃ 45 s，55～58℃ 30 s，72℃ 45 s，共30个循环， 最后72℃延伸10 min。取8 mL PCR扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，以凝胶图像分析仪(Bio-Rad公司)Imaging软件分析 Claudin-1的灰度值，数据以检测基因与内参照 β-肌动蛋白灰度值比值表示。Claudin-1引物序列：上游5’-CCTGCCCCAATGGAAGATTT-3’，下游5’-CCGATGACAGCCATCCACAT-3’。β-肌动蛋白引物序列：上游5’-ACGGTCAGGTCATCACTACG-3’，下游5’-GGCATAGAGGT CTTTACGG ATG-3’。

1.5免疫印迹实验细胞处理后，加入蛋白裂解液收集蛋白后BCA法进行蛋白定量，按每孔蛋白上样量为30 μg进行SDS-PAGE电泳。之后将蛋白转移至PVDF膜上，用含5%小牛血清白蛋白的TBST溶液室温封闭30 min后，分别与抗claudin-1单克隆抗体，抗β-actin单克隆抗体4℃孵育过夜，洗膜后与二抗(HRP标记的鼠抗)室温孵育1 h，之后加入ECL试剂显影，采用凝胶图像分析仪(Bio-Rad公司)拍照，并对条带感光密度进行定量分析。

1.6肠上皮细胞跨上皮电阻(transepithelial electrical resistance，TER)检测IEC-6细胞以 5×105密度每孔接种于24孔板的Transwell小室内，24 h更换培养基，并用电阻测定仪测定TER，待期数值稳定后进行缺氧处理，之后检测处理TER值，以原始数值减去空白对照 (小室内未接种细胞)数值表示。

2　结果

2.1缺氧导致HIF 1α表达增加、claudin-1表达降低与常氧组比较，缺氧4 h后继续培养细胞至24 h、48 h、72 h，ELISA结果显示HIF 1α表达增多，最高峰为48 h，差异有显著统计学意义(P<0.01；P<0.001)，见表1。与常氧组比较，缺氧4 h后继续培养细胞至24 h、48 h、72 h，免疫印迹结果显示claudin-1显著下降，以缺氧后48 h表达量最低，差异有显著统计学意义(P<0.01；P<0.001)，见图1。

表1　缺氧对不同培养时间IEC-6 HIF 1α

注：与常氧组比较，*P<0.01；**P<0.001。

图1　免疫印迹法检测常氧组(对照)、缺氧后不同时间Claudin-1蛋白表达　　A. 免疫印迹蛋白条带。CON：常氧组；1：缺氧4 h后培养24 h组；2：缺氧4 h后培养48 h组；3：缺氧4 h后培养72 h组。B.灰度分析统计图。n=3，与对照组比较，*P<0.01；**P<0.001。

2.2缺氧降低TER与常氧组比较缺氧4 h后继续培养细胞至24 h、48 h、72 h，TER明显降低，以48 h降低为最大幅度，差异有统计学意义(P<0.01；P<0.001)，见表2。

表2缺氧对IEC-6 TER的影响

组别培养24h培养48h培养72h常氧组126.6±10.8134.5±11.6140.8±11.5缺氧组90.4±8.6*71.5±8.2**88.6±10.3*

注：与常氧组比较，*P<0.01；**P<0.001。

2.3降低IEC-6细胞claudin-1 mRNA表达在常氧状态下，以重组HIF 1α蛋白(10 ng/mL)处理IEC-6细胞 24～72 h后，可见claudin-1 mRNA表达明显下调，呈时间依赖性(P<0.01；P<0.001)，见图2。

图2　RT-PCR检测常氧条件下HIF 1α组处理IEC-6细胞24～72 h后Claudin-1 mRNA表达 CON：对照组，未加HIF 1α处理；1：HIF 1α处理24 h组；2：HIF 1α处理48 h组；3：HIF 1α处理72 h组。n=3，与对照组比较，*P<0.01；**P<0.001。

3　讨论

正常的肠道屏障功能可阻止肠腔内细菌、内毒素等抗原侵入机体，具有重要的防御作用。在各种内外病理性因素如应激、感染等刺激之下，肠上皮屏障功能受损，通透性增加，肠道细菌、内毒素等可进入全身血循环，严重者可引发全身性炎症反应综合征、多器官功能障碍等[4-5]。肠道屏障可分为机械屏障、免疫屏障、生物屏障和化学屏障，其中以机械屏障最为重要。近年来的研究表明，多种内外病理性因素刺激可导致肠道局部微环境缺氧，导致肠道的机械屏障功能受损，但其机制并不十分清楚[6]。本组结果表明，缺氧可诱导肠道上皮细胞表达HIF1α表达增多，后者可抑制TJ关键性的结构蛋白claudin-1的表达，进而影响肠道机械屏障功能。

在缺氧条件下，细胞最重要的应答反应之一即为HIF1α的诱导性表达上调。HIF1α普遍存在于人和哺乳动物细胞内，在常氧状态下(21%O2)有低度表达，但其在缺氧条件下才可稳定表达[7]。HIF1α蛋白N末端和C末端均存在反式激活结构域(transactivationdomain,TAD)，即TAD-C和TAD-N，其中TAD-C发挥精细调整作用，TAD-N为激活转录所必需。作为参与缺氧适应性反应的重要核转录因子，表达增加的HIF1α蛋白转位入细胞核，与HIF1β形成异源二聚体复合物，后者识别并与靶基因调控序列的缺氧反应元件(hypoxiaresponseelement，HRE)相结合，调控靶基因的表达[8]。本研究结果显示，claudin-1 表达受到HIF1α蛋白调控，说明claudin-1基因为HIF1α的靶基因。基因启动子序列分析发现，claudin-1基因启动子区域存在多个HRE序列，这可能是HIF1α发挥作用的基础。后续我们将进一步采用染色质免疫沉淀的方法，对二者之间的结合进行确认。

TJ的分子成分包括细胞之间内在的跨膜蛋白、连接粘附分子和若干胞质附着蛋白，其中claudin是TJ最重要的结构基础[9]。claudins属于跨膜蛋白，目前已发现其有24个家族成员，其中claudin-1是组成TJ的必要组成部分，其蛋白羧基端和氨基端都在胞质与构成细胞骨架的肌动蛋白相连。多种疾病与claudin-1 蛋白表达或突变有关。例如慢性酗酒患者肠屏障性结构受损，这与claudin-1表达降低有关[10]；claudin-1蛋白基因缺乏与致死性皮肤渗透性缺陷病密切相关等[11]。本研究发现，claudin-1表达降低的同时，肠上皮细胞跨上皮电阻明显降低，说明肠上皮黏膜屏障功能受损。他人的工作也表明：以特异性抑制剂环巴胺阻止claudin-1蛋白表达下调后，可改善缺氧导致的肠上皮细胞屏障功能损伤。

综上所述，缺氧状态下IEC-6细胞分泌HIF1α增多，可抑制claudin-1表达，进而增强肠上皮细胞通透性，导致屏障功能受损。进一步对claudin在TJ中的结合方式、调节过程等方面开展研究，将为缺氧所致的肠上皮黏膜屏障功能受损提供新的防治靶点。

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责任编辑：牟冬生

Human Hypoxia-Inducible Factor 1α Suppresses Claudin-1 Expression and Impairs Intestinal Epithelial Barrier Function

Xu Weihua,Gao Shengdong

(Department of Digestion in the First People′s Hospital of Xiaochang,Xiaochang 432900,China)

国家自然科学基金青年项目(81302112)。

徐卫华(1968- )，男，湖北孝昌人，副主任医师，研究方向：炎症性肠病。

R363

A

1008-8164(2016)02-0006-04

2016-03-05