DNA连接酶4及热休克蛋白B1基因单核苷酸多态性与鼻咽癌易感性的相关性

刘　丹　赵玉霞　于　洪　屈艳丽　高　雅　陈　颖

(中国医科大学附属第四医院肿瘤放射治疗科，辽宁　沈阳　110032)



DNA连接酶4及热休克蛋白B1基因单核苷酸多态性与鼻咽癌易感性的相关性

刘丹赵玉霞于洪1屈艳丽1高雅陈颖

(中国医科大学附属第四医院肿瘤放射治疗科，辽宁沈阳110032)

〔摘要〕目的探讨DNA连接酶4(LIG4)和热休克蛋白B1(HSPB1)基因单核苷酸多态性与鼻咽癌易感性的关系。方法采用病例-对照研究和Taqman real-time PCR对193例鼻咽癌患者和211例健康对照组外周血DNA进行单核苷酸多态性的基因分型。结果LIG4C/T(rs1805388)和HSPB1C/G(rs2868371)的基因型分布在鼻咽癌组和健康对照组之间无明显差异(P>0.05)。单因素及多因素分析显示LIG4C/T(rs1805388)和HSPB1C/G(rs2868371)位点多态性与鼻咽癌发生风险无关。结论LIG4rs1805388和HSPB1rs2868371基因多态性与鼻咽癌易感性无关。

〔关键词〕鼻咽癌；DNA连接酶4；热休克蛋白B1；单核苷酸多态性；易感性

鼻咽癌的发病具有明显的地域和种族差异，存在家族高发倾向，在中国南方和东南亚国家或地区高发。目前认为鼻咽癌是一种多基因遗传病，发病过程中涉及多个基因之间或基因与环境之间的交互作用〔1〕。DNA连接酶(LIG)4是DNA双链断裂(DSB)非同源末端链接(NHEJ)修复通路中一个重要的修复因子〔2,3〕。热休克蛋白(HSP)B1在肿瘤基因表达、DNA修复、蛋白分子伴侣、免疫应答、信号转导以及细胞分化、增殖、细胞衰老或细胞无限繁殖中起着重要的作用〔4〕。LIG4和HSPB1的基因单核苷酸多态性与胶质瘤、肺癌等多种肿瘤的易感性相关，目前尚未见两者与鼻咽癌易感性的研究。本研究探讨LIG4和HSPB1基因单核苷酸多态性(SNP)与鼻咽癌易感性的关系。

1材料与方法

1.1研究对象病例组来自2010年9月至2012年3月中国医科大学附属第一医院和辽宁省肿瘤医院，有明确的病理诊断原发性鼻咽癌患者193例。211例健康对照组来自上述医院同期就诊的非肿瘤患者，按性别、年龄(±3岁)、吸烟状况与病例频数匹配。均为汉族，患者之间、对照之间、患者与对照之间彼此均无亲缘关系。在签署知情同意书后，提供外周血标本，同时完成流行病学调查。病例组193例，男132例，女61例，年龄13～78(中位52)岁，吸烟者76例，15例无法知道吸烟否。健康对照组211例，男146例，女65例，年龄17～78(中位52)岁，吸烟者65例，两组年龄(P=8.08)、性别(P=0.862)无差异，吸烟者比例有差异(P=0.15)。

1.2调查方法及外周血采集采用统一制定的调查表，由两名培训的调查员对病例及对照组进行流行病学调查，调查内容包括每个研究对象详细的人口学资料、发病年龄、吸烟史、家族患癌史、职业史、手术史、放化疗史，病变位置、肿瘤大小、组织类型、临床表现、伴发疾病以及饮食等生活习惯。非吸烟者定义为终生吸烟少于100支的个体。所有调查资料经反复检查、核对和编码后，用Excel软件进行数据录入。所有参与研究的个体外周血标本采集使用枸橼酸钠抗凝试管，每人采血2 ml，在-20℃或-80℃的冰箱中冻存。

1.3实验方法集中进行基因组DNA提取，采用酚-氯仿法，提取后测OD值确定DNA的原始浓度，再倍比稀释到30～100 ng/μl的终浓度备用。采用Taqman real-time PCR方法进行单核苷酸多态性的基因分型。基因分型在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行，扩增条件为：95℃预变性10 min；92℃变性30 s，60℃退火以及延伸1 min；共47个循环。以SDS(美国应用生物系统公司)软件Allelic Discrimination程序进行终点分析，通过检测不同等位基因所标记的FAM和VIC荧光强度，判断待测样本的基因型。

1.4质量控制流行病学调查质量控制：所有调查员都接受为期一周的标准化培训；使用统一的简明易懂的调查表；流行病学学科专家监督指导；随机抽取10%的样本二重调查，并与原始记录核对；随机抽取10%的病历，检查其完整性和准确性；编制编码手册，以检验调查表编码情况并评价数据录入工作；记录调查过程中遇到的所有问题；为减少误差，对病例和对照的调查工作在报告后2个月内完成；编制包含详细的收集、分析、保存和运输等内容的手册。实验室质量控制：在每个96孔检测单元中分别设立阴性对照和重复标本作为质量控制；阴性对照中不加模板DNA，而以双蒸水代替，用于检验是否存在PCR污染。每个SNP的信号强度需在两个尺度上满足形成三个明显的簇，由ABI的SDS软件完成。进行基因分型时实验者对于标本的病例对照状态未知。随机选择10%的样本进行盲法重复测量。

1.5统计学分析利用SPSS13.0软件进行数据分析，以χ2检验检查比较人口学特征、相关危险因素暴露及SNPs基因型在病例与对照之间分布的差异；以拟合优度χ2检验检查对照的Hardy-Weinberg分布平衡情况；以单因素和多因素Logistic回归计算比值比(OR)及95%可信区间(CI)表示相对危险度。

2结果

检测的2个SNPs的基因型在健康对照组的分布频率经χ2检验，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)。LIG4C/T(rs1805388)和HSPB1C/G(rs2868371)的基因型分布在鼻咽癌组和健康对照组之间无明显差异(P>0.05)。单因素分析及纳入年龄、性别及吸烟状态多因素分析显示LIG4C/T(rs1805388)和HSPB1C/G(rs2868371)位点多态性与鼻咽癌发生风险无关。见表1。

表1　各基因型与鼻咽癌易感性的相关性〔n(%)〕

1)单因素分析结果；2)多因素分析结果；3)有数据缺失

3讨论

哺乳动物细胞中DNA双链断裂后最主要通过激活NHEJ通路修复断裂的DNA双链。哺乳动物细胞中参与NHEJ机制的核心组分包括DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)、X射线修复交叉互补蛋白4(XRCC4)、Ku70(XRCC6),Ku80(XRCC5)，DNA连接酶Ⅳ〔5〕。DNA双链断裂修复能力与癌症易感性相关，当NHEJ修复通路中的基因突变或缺失，则导致DNA损伤修复能力降低致肿瘤的发生。Liu等〔6〕发现LIG4rs3093739位点的C基因增加胶质瘤的患病风险，而LIG4rs1805388位点基因多态性与胶质瘤的患病风险无关。Zhao等〔7〕对400余例胶质瘤的病例对照研究发现LIG4rs1805388位点的T基因增加胶质瘤的患病风险(OR=3.27)。Li等〔8〕研究发现LIG4 rs 1805388位点的C基因增加有糖尿病史人群患胰腺癌的风险。英国的一项研究显示〔9〕LIG4(T>C nt 1977)的C等位基因可降低乳腺癌发病风险(OR=0.7)。目前未见LIG4rs1805388基因多态性与鼻咽癌易感性的报道。本实验首次研究了LIG4rs1805388位点基因多态性与辽宁汉族人群鼻咽癌发病风险的关系。本研究结果显示:LIG4rs1805388位点存在CC、CT和TT三种基因型,其中健康对照组的CC型为64.9%，CT为30.8%，TT为4.3%,这与国内Liu等〔6〕的报道一致。鼻咽癌患者组的CC型为70.8%，CT为23.4%，TT为5.7%，鼻咽癌患者组与正常对照组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。

HSPB1参与多种肿瘤的发生、发展和预后。郭云鸿等〔10〕研究发现HSP27在宫颈癌组织高表达，与病理分级密切相关，提示HSP27可能参与了宫颈鳞癌的早期发生。研究显示HSP27 在肺癌组织中有广泛表达，在临床有转移和病理细胞分化低的组织中表达增高〔11〕。Guo等〔12〕研究发现HSPB1-1271G>C多态性与肺癌易感性相关，GC基因型能显著增加肺癌发病风险。目前未见HSPB1rs2868371基因多态性与鼻咽癌的易感性的报道。本研究认为HSPB1rs2868371基因多态性与鼻咽癌的易感性的无关。

综上，LIG4rs1805388和 HSPB1rs2868371基因多态性与鼻咽癌易感性无关。目前,基因多态性与肿瘤发病风险的关系不是很明确,来自不同民族、不同地区的研究对象可能得到不同、甚至矛盾的结果,这可能与遗传因素的地域性和种族性有关,还有可能是与样本含量较小有关，LIG4rs1805388和 HSPB1rs2868371位点纯合突变率均较低，小样本结果不能达到应有的统计效能。所以LIG4rs1805388和 HSPB1rs2868371基因多态性与鼻咽癌发病风险的关系还有待于进一步研究。

4参考文献

1殷蔚伯，余子豪，徐国镇，等.肿瘤放射治疗学〔M〕.第4版.北京:中国协和医科大学出版社，2008:443-4.

2Ahnesorg P，Smith P，Jackson SP.XLF interacts with the XRCC4-DNA ligaseⅣ complex to promote DNA nonhomologous end-joining〔J〕.Cell，2006；124(4)：301-3.

3Sakata K，Someya M，Matsumoto Y，etal.Ability to repair DNA double-strand breaks related to cancer susceptibility and radiosensitivity〔J〕.Radiat Med，2007；25(9)：433-8.

4Garrido C，Brunet M，Didelot C，etal.Heat shock proteins 27 and 70：anti-apoptotic proteins with tumorigenic properties〔J〕.Cell Cycle，2006；5(22)：2592-601.

5Lieber MR.The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway〔J〕.Ann Rev Biochem，2010；79:181-211.

6Liu YH,Zhou KK,Zhang HS,etal.Polymorphisms of LIG4 and XRCC4 involved in the NHEJ pathway interact to modify risk of Glioma〔J〕.Hum Mutation，2008;29(3):381-9.

7Zhao P，Zou P，Zhao L，etal.Genetic polymorphisms of DNA double-strandbreak repair pathway genes and glioma susceptibility〔J〕.BMC Cancer，2013；13(1)：234.

8Li DH,Suzuki HA,Liu BR,etal.DNA repair gene polymorphisms and risk of pancreatic cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2009;15(2):740-6.

9Bettina Kuschel,Annika Auranen,Simon McBride,etal.Variants in DNA double-strand break repair genes and breast cancer susceptibility〔J〕.Human Mole Genet，2002；11(12):1399-407.

10郭云鸿，周小燕，吴向晖，等.热休克蛋白27及Bcl-2在宫颈鳞癌中的表达及意义〔J〕.河南科技大学学报(医学版)，2009；27(1)：14-6.

11赵勇刚，谢伟，冯茂辉，等.热休克蛋白 27 在肺癌中的表达及其临床意义〔J〕.中国现代医学杂志，2009；19(8)：1192-4.

12Guo H,Bai Y,Xu P,etal.Functional promoter-127G>C variant of HSBP1 predicts lung cancer risk and survival〔J〕.J Clin Oncol，2010；28:1928-35.

〔2014-05-15修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

基金项目：辽宁省科技厅科学计划项目(No.2011225019)；沈阳市社会发展科技攻关项目(No.F12-193-9-40)

通讯作者：赵玉霞(1962-)，女，教授，博士生导师，主要从事肺癌、鼻咽癌和放射性损伤的研究。

〔中图分类号〕R739.6

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)12-2951-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.060

1辽宁省肿瘤医院肿瘤放射治疗三科

第一作者：刘丹(1979-)，女，主治医师，博士，主要从事肺癌及放射性肺损伤的基础和临床研究。