硫辛酸对大鼠多发性脑梗死的神经保护作用

杜　斌　杨志勇　范红斌　庞庆丰　邱丽颖

(江南大学无锡医学院基础医学系，江苏　无锡　214122)



硫辛酸对大鼠多发性脑梗死的神经保护作用

杜斌杨志勇1范红斌庞庆丰邱丽颖

(江南大学无锡医学院基础医学系，江苏无锡214122)

〔摘要〕目的探讨硫辛酸(LA)对大鼠多发性脑梗死(MCI)神经保护的作用机制。方法将雄性SD大鼠随机分为四组,即假手术组、模型组、LA高剂量组、低剂量组,每组8只。给药3 d后观察对大鼠神经系统症状体征评分。给药4 d后观察硫辛酸对大鼠MCI体重的变化、脑病理形态、脑组织中钙调神经磷酸酶(CaN)、乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响。结果给药4 d时体重变化明显。术后3 d时神经系统症状体征评分有显著改变。脑组织病理切片显示神经细胞排列不整齐,神经元数目明显减少(P<0.05)。与模型组比较，LA低剂量组、高剂量组脑组织中CaN、LDH、NO含量下降，SOD活性增高(P<0.05)。高剂量组与低剂量组比较有差异(P<0.05)。结论LA可通过保护脑组织抗氧化酶的活性，减轻自由基对脑组织损伤，对MCI有保护作用。

〔关键词〕硫辛酸；多发性脑梗死；神经保护

多发性脑梗死(MCI)是指脑内有多个因缺血而产生的软化梗死灶,又称为多发性脑软化。在病理生理机制中，认为与氧自由基产生、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、单胺神经递质毒性等有关〔1〕。硫辛酸(LA)可存在于细胞内及细胞外，可以清除脂溶性或水溶性自由基，促进线粒体的葡萄糖代谢循环、增加能量产生、影响新陈代谢、缓解炎症、增强免疫系统,还能启动细胞的修复机制〔2〕。LA作为神经细胞的抗氧化损伤保护剂已越来越引起关注。本文研究LA对MCI的神经保护作用并探讨其机制。

1材料和方法

1.1实验材料健康雄性清洁级SD成年大鼠32只，体重(250±20)g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号码：SCXK(沪)2012-0002，LA购自Sigma公司，批号：12705243；生化试剂盒：购自南京建成生物工程研究所；其余试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1动物模型制备32只大鼠，随机分为四组，假手术组、模型组、LA高剂量组、低剂量组,每组8只。术前12 h禁食，自由饮水。模型组采用改良Kaneko法制造MCI模型〔3〕。同种SD 大鼠尾静脉采血,于37℃温箱内干燥,研碎后用200 nm 筛孔过筛,制成血栓栓子,应用时取栓子1 mg加生理盐水0.5 ml,摇匀成混悬液。10%水合氯醛按35 mg/100 g 体重腹腔注射麻醉,颈正中切开皮肤,剥离肌肉,暴露颈总动脉、颈外动脉与颈内动脉,暂时夹闭颈总动脉,于颈外动脉逆行插管注入栓子溶液0.3 ml,推注同时开放颈总动脉,使栓子通过颈内动脉进入颅内至大脑各动脉,造成MCI,然后结扎颈外动脉,缝合皮肤。假手术组同样麻醉剥离并暴露颈动脉后便缝合皮肤。LA低剂量组术后每天灌胃100 mg/kg，高剂量组每天灌胃200 mg/kg，假手术组、模型组每天灌胃等量生理盐水，共4 d。术后第4天统一处死。

1.2.2神经系统症状体征评分评分标准采用日本永冈明申的脑卒中症状体征评分标准〔4〕:0分:正常;1分:运动量轻度减少,或轻度兴奋;2分:运动量明显减少,或激惹性亢进;3分:不能行走,忧郁性症状(体卧不动);4分:不能站立,体肢麻痹(瘫痪)或任何一侧体肢瘫痪。观察方法:每天评分两次(用恫吓的方式查看大鼠的反应和活动能力),以3 d评分的平均分评价脑梗死症状及体征变化的程度。

1.2.3病理形态的观察迅速断头取血后处死，迅速取出脑标本，然后将脑组织固定于10%甲醛溶液内，24 h后，从冠状面取中央前回和中央后回组织各一块，常规脱水，石蜡包埋，切片(厚度4 μm),HE染色，光镜检查。

1.2.4大鼠脑组织钙调神经磷酸酶(CaN)、乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性测定给药4 d时迅速断头取血，分离血清样本，CaN、LDH、NO、SOD的测定严格按试剂盒说明进行。

1.3统计学处理采用SPSS17.0软件进行t检验。

2结果

2.1MCI 模型大鼠外观形态造模动物共34只,存活32只,存活率达94.15%，所有存活大鼠均发生脑梗死,脑梗死发生率为100%。发生脑梗死大鼠症状轻重不等,轻者出现运动减少,易激惹,重者出现行走转圈或不能站立、身体向一侧倾倒,完全偏瘫,或抽搐、大便失禁等。用手提起大鼠尾部,大鼠患侧肢体下垂,四肢伸出不对称。

2.2大鼠MCI后体重变化术后1 d体重无变化(P>0.05)。术后4 d与模型组比较，体重变化有显著差异(P<0.01)。见表1。

2.3神经系统症状体征评分假手术组大鼠术后3 d神经系统症症状体征评分为0，模型组、LA低剂量组及LA高剂量组分别为2.75±0.71、1.37±0.74、1.12±0.64。与模型组比较，各组均有显著差异(P<0.01)。

2.4脑组织病理学变化光镜下见假手术组大鼠神经细胞核

表1　大鼠MIC后体重变化

与模型组比较：1)P<0.01；与低剂量组比较：2)P<0.01，下表同

大,核膜清晰、核仁明显。神经细胞数目多，呈多层排列，且紧密、整齐,神经细胞结构和分布正常,未见软化灶,神经纤维走向规则。模型组大鼠神经细胞排列不整齐、稀松、不规则,脱失现象严重、神经元数目明显减少、胞核固缩等缺血性改变，神经纤维走向紊乱。LA低剂量组、高剂量组可见大脑皮质细胞部分消失，数量减少，胶质细胞增生，胞核深染，形态大小不一。见图 1。

2.5各组大鼠脑组织CaN、LDH、NO、SOD活性含量与模型组比较，LA低剂量组、高剂量组脑组织中CaN、LDH、NO含量下降，SOD活性增高。LA高剂量组与低剂量组比较有显著差异(P<0.01)。见表2。

图1　MCI脑组织病理学变化(HE,×100)

组别CaN(OD636/mgprot)LDH(nU/mg)NO(μmol/gprot)SOD(U/gprot)假手术组4.50±0.251)9.45±0.161)0.78±0.0721)8.31±0.111)模型组8.01±0.1813.84±0.131.53±0.174.87±0.31LA低剂量组6.13±0.111)11.43±0.111)0.91±0.071)5.61±0.071)LA高剂量组4.32±0.131)2)10.10±0.191)2)0.86±0.031)6.38±0.081)2)

3讨论

大鼠MCI模型建立同线栓法脑缺血再灌注损伤相比，其病理生理学过程更相似人类脑梗死的发病机制。MCI会产生自由基连锁反应。因此,MCI早期抗自由基治疗是非常必要的。自然界存在的硫辛酸具有氧化型和还原型两种形态。生物体内氧化型和还原型相互转化时多种活性氧被清除，构成机体独特的抗氧化剂循环代谢网络，被称为万能抗氧化剂〔5〕。

CaN 作为一种使底物脱磷酸化的蛋白磷酸酶，参与全身性应激反应引起的磷酸化反应，维持重要器官磷酸化反应平衡中有重要意义〔6〕。LA高剂量组对MCI治疗过程中，CaN含量接近假手术组，说明LA对调节磷酸化反应有影响。SOD 是机体清除自由基的主要酶，SOD活性高低间接反映脑组织清除自由基的能力，对脑缺血有神经保护作用〔7〕。LA低、高剂量组SOD活性明显高于模型组，说明LA对清除自由基有影响。NO是体内一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸和O2氧化产生的，可被氧自由基、血红蛋白等迅速灭活。内皮型NOS合酶产生NO能够扩张血管，具有神经保护作用。LA给药后的神经保护作用，可能是脑缺血和再灌注过程中LA通过升高NO水平增强流经大脑动脉的血流量实现的〔7〕。MCI面积越大，细胞破坏越多，脑组织中的LDH 活性越低。因此LDH 是脑组织损害最敏感的酶，可准确反映脑组织细胞受损的程度〔8〕。Tagliari 等〔9〕认为，LDH 从损伤的细胞内溢出，可通过测量LDH 的变化来定量分析脑细胞损伤的程度。钙离子在LA神经保护作用中起到调控功能,进一步说明LA有神经保护作用〔10〕。LA对糖尿病大鼠大脑皮质有保护作用，其机制可能与下调核因子-κB、糖化终产物受体(RAGE)等表达，改善大脑退行性病变有关〔11〕。研究结果表明LA给药后脑细胞损伤程度有所好转，可以推断LA对MCI有神经保护作用，其机制可能与LA的抗氧化性有关。

4参考文献

1杜斌,邱丽颖,范红斌,等.硫辛酸对重要脏器缺血再灌注损伤保护作用的研究进展〔J〕.广东药学院学报，2010；26(3)：326-9.

2Ghibu S,Richard C,Delemasure S,etal.An endogenous dithiol with antioxidant properties:alpha-lipoic acid potential uses in cardiovascular diseases〔J〕.Ann Cardiol Anreiol(Paris),2008；57(3):161-5.

3Kaneko D,Nakamura N,Ogawa T.Cerebral infarction in rats using homologous blood emboli:development of a new experimental model 〔J〕.Stroke,1985；16(1):76-84.

4永冈明伸,垣花满,藤原一男.易卒中型自发性高血压大鼠的脑血管损害以及CV- 2619 对其神经系统症状的改善作用〔J〕.药理与治疗,1984；12(12):5345- 51.

5Goraca A,Huk-Kolega H,Piechota A,etal.Lipoic acid-biological activity and therapeutic potential〔J〕.Pharmacol Rep,2011；63:849-58.

6邱丽颖，杨志勇，杜斌，等.脑缺血再灌注损伤大鼠重要脏器钙调神经磷酸酶活性变化及阿司匹林的干预作用〔J〕.中国老年学杂志，2010；30(5):640-2.

7Connella BJ,Saleha M,Khanb BV,etal.Lipoic acid protects against reperfusion injury in the early stages of cerebral ischemia 〔J〕.Brain Res,2011；1357:128-36.

8张洪，童萼塘，梅元武，等．大鼠脑缺血再灌流时检测血中脑细胞胞浆酶的意义〔J〕.卒中与神经疾病，2000；7(1):17.

9Tagliari B,Zamin LL,Salbego CG,etal．Homocysteine increases neuronal damage in hippocampal slices receiving oxygen and glucose deprivation〔J〕.Metab Brain Dis，2006；21(4):273.

10Richarda MJP,Connella BJ,Khanb BV,etal.Cellular mechanisms by which lipoic acid confers protection during the early stages of cerebral ischemia:a possible role for calcium〔J〕.Neurosci Res,2011；69：299-307.

11白星子，王国贤，李飞.α-硫辛酸对2型糖尿病大鼠大脑皮质的保护作用〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(3):620-2.

〔2014-11-30修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

通讯作者：邱丽颖(1965-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事心脑血管病病因学与药物治疗和中药药理研究。

〔中图分类号〕R365

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)12-2867-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.018

1阜阳市人民医院特需病房

第一作者：杜斌(1983-)，男，实验师，主要从事药理学研究。