鬼针草水提物对脂多糖诱导肝损伤小鼠肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6的影响

周毕军　赵　岩　黄川锋

(南阳医学高等专科学校外科教研室，河南　南阳　473000)



鬼针草水提物对脂多糖诱导肝损伤小鼠肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6的影响

周毕军赵岩黄川锋

(南阳医学高等专科学校外科教研室，河南南阳473000)

〔摘要〕目的研究鬼针草水提物对脂多糖(LPS)诱导小鼠肝损伤的保护作用及对小鼠细胞因子的影响。方法一次性腹腔注射LPS(400 μg/kg)建立小鼠化学性肝损伤模型，鬼针草水提物灌胃，测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷酰转肽酶(GGT)、肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6的水平和肝匀浆中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量，肝组织HE染色作病理切片分析。结果鬼针草水提物可明显改善 LPS 引起的小鼠肝组织病理损伤，降低 LPS致小鼠血浆ALT、GGT、TNF-α和IL-6的水平，GSH-Px活性明显增高，肝细胞水肿、变性等损伤程度明显减轻。结论鬼针草水提物能够明显降低急性肝损伤小鼠TNF-α、IL-6水平，减轻氧化应激损伤，具有较强的保肝作用。

〔关键词〕鬼针草水提物；脂多糖；急性肝损伤；细胞因子

肝损伤是多种肝脏疾病共有的一种病理状态，药物和毒物引起的肝损伤是一种常见的病理损害，其长期存在往往导致肝纤维化，甚至成为肝硬化、肝癌发生的使动因素〔1〕。研究表明中药及其有效成分可以通过减少致炎相关介质的产生、促进肝脏循环和肝细胞再生等方面保护肝细胞、预防肝损害〔2〕。鬼针草为菊科一年生草本植物，作为常用中草药，应用十分广泛〔3〕。马瑜红等〔4〕的实验研究表明：鬼针草提取物能降低动物模型的血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平和肝匀浆丙二醛(MDA)含量，具有一定的保肝作用，且与药物剂量有关。刘韦成等〔5〕通过实验证实了脂多糖(LPS)单独诱导急性肝损伤模型，是一种简易实用的急性肝损伤动物模型建立的方法。本项研究从细胞和分子水平探讨鬼针草水提物对LPS诱导小鼠肝损伤的保护作用及对小鼠细胞因子的影响。

1材料与方法

1.1实验动物昆明种雄性小鼠50只，3月龄，体质量160～190 g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。大鼠每笼5只，分笼喂养，房间温度平均20℃，相对湿度为40%～60%，光线为12 h明暗循环〔6〕，保持笼内清洁。

1.2试剂LPS购自上海基免实业有限公司；ALT、AST试剂盒购自上海科华生产；肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6试剂盒均购自上海博研生物科技有限公司。MDA、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3试验方法制备鬼针草水提物：采集、鉴定鬼针草，制备鬼针草水提取物，浓度为每毫升含1 g生药。昆明种雄性小鼠50只，随机分为五组：正常组、模型组、鬼针草水提物低、中、高剂量组。低、中、高剂量组分别用以3.0、6.0、12 g·kg-1·d-1剂量灌胃，正常组与模型组灌胃等量生理盐水，每日一次，连续3 w。实验期间动物正常饮水，以标准颗粒饲料喂养。末次灌胃后禁食12 h，除正常组组外，其余各组小鼠均一次性腹腔注射LPS(400 μg/kg)建立小鼠肝损伤模型，正常组腹腔注射同等剂量的生理盐水，观察动物的一般情况及死亡情况。

1.4标本检测造模12 h后处死小鼠，快速摘取小鼠眼球采血制备血清〔7〕，血液离心后血清送生化室检测ALT、AST；迅速解剖，取小鼠肝脏作HE染色，观察组织形态与受损情况；取肝组织(0.5～1 g)在冰冷的生理盐水中漂洗，在冰浴中制备肝匀浆并测定MDA、SOD含量，使用TU-1810分光光度计测定，均按说明书操作〔8〕。

1.5统计学方法采用SPSS16.0统计软件行t检验。

2结果

2.1各组小鼠转氨酶及细胞因子水平变化与模型组比较，干预组ALT、AST、TNF-α、IL-6均显著降低(P<0.05)。见表1。

表1　各组小鼠转氨酶及细胞因子水平比较±s,n=10)

与正常组比较：1)P<0.01,2)P<0.05；与模型组比较：3)P<0.01,4)P<0.05

2.2肝组织MDA、SOD、GSH-Px的变化与模型组比较，鬼针草高剂量组MDA显著降低(P<0.05)，鬼针草中、高剂量组明显增高(P<0.05)，但均未恢复至正常水平。见表2。

2.3肝组织病理切片结果正常组小鼠肝组织结构完整、清晰，细胞大小一致。模型组周围水肿，肝索紊乱、大量炎症细胞浸润。鬼针草中、高剂量组较模型组病变明显减轻，肝细胞形态、大小基本正常，只有少极少量炎症细胞浸润。见图1。

正常组　　　　　　　　　　　　　模型组　　　　　　　　　　鬼针草中剂量组　　　　　　　　　鬼针草高剂量组图1　各组小鼠肝组织病理变化(HE，×100)

表2　各组小鼠MDA、SOD、GSH-Px水平比较

与模型组比较:1)P<0.05，2)P<0.01

3讨论

LPS是革兰阴性菌胞壁内毒素的主要成分，也是革兰阴性菌激发宿主免疫应答导致机体损伤的主要因素〔9〕。肝脏是肠源性内毒素攻击的首要器官，也是免疫损伤的常见靶器官。更为重要的是它可以刺激肝内单核/巨噬细胞系统活化，生成大量炎性因子如TNF-α、IL-1及IL-6等，触发级联反应，对肝脏造成较为持久而且广泛的损伤〔10，11〕。TNF-α、IL-6是由肝Kupffer细胞表达和分泌的炎性细胞因子，这些细胞因子进一步刺激相邻的肝细胞和附近的Kupffer细胞表达TNF-α、IL-6〔12〕。TNF-α对肝细胞的直接致伤作用可通过肝细胞膜上的膜肿瘤坏死因子受体(TNF-R)上调，已知TNF-α与mTNFR结合，可通过一系列信号传导途径最终激活细胞内多种非溶酶体性脱氧核糖核酸内切酶，将肝细胞双链基因组DNA切割成寡脱氧核苷酸片段，从而使肝细胞凋亡，破坏和排除大量肝细胞。

IL-6的生物学活性广泛，能诱导B细胞增殖分化并产生抗体，使免疫复合物的形成增多，可以通过经典或旁路途径激活补体，引起炎症反应和靶细胞的损伤；诱导细胞毒性T细胞(CTL)的活性，增强CTL杀伤靶细胞的能力，导致肝脏炎症和免疫损伤；另外也是急性期反应蛋白如C反应蛋白的强力诱导剂，后者升高可加重肝脏的病理损伤〔13〕。

本研究结果证明，模型组的ALT、AST、TNF-α、IL-6明显高于正常组，进一步证明肝细胞受到损伤。鬼针草水提物中、高剂量组与模型组相比，ALT、AST、TNF-α、IL-6明显降低，病理检查肝细胞病变明显减轻，鬼针草水提物高剂量组肝细胞形态、大小未见明显异常，肝中央静脉结构完整，表明鬼针草水提物具有保肝作用，能明显减轻肝损害。导致肝细胞坏死损伤的重要因素之一是氧自由基(OFR)的生成，导致MDA增多〔14〕。GSH是体内重要的抗氧化酶，能清除自由基，保护细胞免受损伤。鬼针草高剂量组MDA显著降低，GSH明显增加，证实鬼针草水提物能够清除自由基，从而减轻肝损害。鬼针草水提物预处理对LPS所致化学性肝损伤具有保护作用〔14〕，可能与降低TNF-α、IL-6水平和减轻氧化应激有关，其详细作用机制有待进一步探讨。

4参考文献

1Sugiyama A，Sata B，Shimizu H，etal.PEgylated lactoferrin enhances its hepatoprotective effects on acute liver injury induced by D-galactosamine and lipopolysaccharide in rats〔J〕.J Vet Med Sci，2010；72(2)：173-80.

2吴素焕，高伟敏.中药抗肝损伤研究进展〔J〕.军医进修学院学报，2009;30(2)：247-9.

3张传伟，王育良.鬼针草的现代研究进展〔J〕.辽宁中医药大学学报，2010;12(6)：38-9.

4马瑜红，李玲，欧阳静萍.鬼针草不同提取物对非酒精性脂肪肝大鼠的实验研究〔J〕.中国中医药咨讯，2011;3(7)：5-6.

5刘韦成，罗学来，李兆明，等.脂多糖诱导小鼠肝损伤模型及致死模型的建立〔J〕.中华实验外科杂志，2012;2(7)：330-2.

6黄川锋，马瑜红，周新，等.鬼针草提取物对实验性高脂血症大鼠血脂和NO及NOS的影响〔J〕.中国现代药物应用，2009；3(17)：14-6.

7陈伟平，谢园沁，胡金鹿，等.紫心甘薯对四氯化碳、卡介苗加脂多糖诱发小鼠肝损伤的保护作用〔J〕.食品与生物技术学报，2011；6(6)：888-90.

8张国良，黄川锋.芦荟苷对急性肝损伤小鼠NO和IFN-γ的影响〔J〕.中药药理与临床，2010；26(1)：27-9.

9游宇，卢放根，刘小伟，等.脂多糖诱发肝损伤机理的初步研究〔J〕.中国医药导报，2013；30(4)：27-9.

10杨颂华，任成山，高全杰，等.内毒素致大鼠急性肝损伤时血清TNF-α、MDA的变化及其意义〔J〕.重庆医学，2003；32(1)：82.

11Levels JH，Lemaire LC，Van Den Ende AE，etal.Lipid composition and lipopolysaccharide binding capacity of lipoproteins in plasma and lymph of patients with systemic inflammatory response syndrome and multiple organ failure〔J〕.Crit Care Med，2013；31(6)：1647.

12黄志华.微生态制剂对肝内胆汁淤积性肝损伤兔模型胆汁和血清TNF-α、IL-6的影响〔J〕.中国微生态学杂志，2010;15(3)：137-40.

13虞岱斌，李亚明，段钟平.细胞因子与肝损伤的关系及人工肝治疗对细胞因子的影响〔J〕.国际移植与血液净化杂志，2006;4(5)：26-8.

14刘士敬.抗炎保肝药物的作用机制和临床应用〔J〕.中国社区医师，2011；9(10)：10-1.

〔2014-12-08修回〕

(编辑安冉冉)

基金项目：南阳市2012年科技攻关发展计划(2012GG046)

〔中图分类号〕R285.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)12-2858-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.014

第一作者：周毕军(1979-)，男，讲师，主要从事普通外科教学、科研与临床研究。