降脂药物对小鼠颈动脉粥样硬化斑块内基质金属蛋白酶3表达的影响

刘　莉　邓远飞　赵　雷

(北京大学深圳医院特诊老年病科，广东　深圳　518036)



降脂药物对小鼠颈动脉粥样硬化斑块内基质金属蛋白酶3表达的影响

刘莉邓远飞赵雷

(北京大学深圳医院特诊老年病科，广东深圳518036)

〔摘要〕目的研究降脂药物对小鼠颈动脉粥样硬化斑块内基质金属蛋白酶(MMP)-3表达的影响，分析降脂药物对颈动脉粥样硬化斑块的作用。方法对照组：10只28周龄SPF级普通雄性小鼠，给予普通饮食，喂养12 w。实验组：20只28周龄载脂蛋白E基因(ApoE)敲除雄性小鼠，给予高脂饮食，喂养12 w后，随机分为非治疗组(10只)，直接进入实验程序；治疗组(10只)给予阿托伐他汀钙片灌胃+普通饮食，继续喂养12 w，进入实验程序：检测各组小鼠血清MMP-3，并分离各组小鼠颈动脉，通过免疫组化分析斑块内MMP-3的表达。结果与对照组比较，非治疗组血清MMP-3明显升高(P<0.01)。非治疗组斑块内MMP-3的表达明显增加(P<0.01)。与非治疗组比较，治疗组血清MMP-3明显下降(P<0.05)。治疗组斑块内MMP-3的表达明显下降(P<0.05)。结论动脉粥样硬化发展过程中，MMP-3起到重要作用，动脉粥样硬化斑块的不稳定与MMP-3的表达增高密切相关。降脂治疗可使斑块内MMP-3降低，使斑块缩小。

〔关键词〕颈动脉粥样硬化斑块；基质金属蛋白酶3；血脂

急性心脑血管事件的主要病理生理机制是动脉粥样硬化(AS)以及在此基础上发生的斑块破裂导致动脉阻塞、狭窄。本研究以ApoE基因敲除小鼠为动物模型，观察基质金属蛋白酶(MMP)-3在颈AS斑块中的表达，探讨MMP-3在AS中的作用机制及降脂药物对颈AS斑块内MMP-3表达的影响。

1材料与方法

1.1动物及分组对照组：10只28周龄SPF级普通雄性小鼠，给予普通饮食，喂养12 w。实验组：20只28周龄载脂蛋白E基因(ApoE)敲除雄性小鼠，给予高脂饮食，喂养12 w后，随机分为非治疗组(10只)，直接进入实验程序；治疗组(10只)给予普通饮食及阿托伐他汀钙(立普妥，辉瑞制药有限公司)用0.9%生理盐水稀释后，以2.5 mg/kg浓度0.5 ml灌胃，每日1次，继续喂养12 w。实验动物均购自南京大学模式动物研究所。

1.2血清MMP-3浓度检测将水合氯醛0.8 ml注入小鼠腹腔麻醉，自股动脉取血，自然凝固30 min后常温3 000 r/min离心15 min，分离血清，由实验中心专业检验员严格按说明书的步骤操作，采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法检测血清MMP-3浓度，在450 nm处测定OD值(MMP-3试剂盒购自美国Rapidbio公司)。

1.3免疫组化检测在颈部分离皮肤、皮下组织，取下颈动脉。10%甲醛固定，石蜡包埋，均匀切片，切片厚度为4 μm，做HE染色，普通光镜下观察组织病理学变化。采取二步法对病理标本进行免疫组化检测(鼠抗人MMP-3免疫组化单克隆抗体和免疫组化试剂盒均购自丹麦DAKO公司)。实验操作严格按试剂盒说明书进行，普通光镜下观察，每例随机观察5个高倍镜(400个细胞视野)，免疫组化阳性染色为细胞质内棕黄色颗粒，根据染色强度分4级：-，无阳性细胞；+，阳性细胞<30%；，阳性细胞30%～60%，，阳性细胞>60%。-～+为低表达，～为高表达。

1.4统计学方法采用SPSS10.0软件行方差分析。

2结果

2.1血清MMP-3水平对照组血清MMP-3水平为(11.06±7.19)μg/L，非治疗组血清MMP-3水平为(20.18±8.03)μg/L明显升高(P<0.01)。治疗组血清MMP-3水平(15.21±8.23)g/L较非治疗组下降(P<0.05)。

2.2免疫组化与对照组相比，非治疗组阳性细胞百分比明显增加，斑块内MMP-3的表达显著高于对照组(P<0.01)。治疗组阳性细胞百分比较非治疗组下降，斑块内MMP-3的表达低于非治疗组(P<0.05)。见表1，图1。

表1　小鼠颈动脉斑块内MMP-3表达(n=10,n)

与对照组比较：1)P<0.01，2)P<0.05

图1　各组大鼠颈动脉AS斑块内MMP-3表达(DAB，×40)

3讨论

MMPs是降解细胞外基质(ECM)最重要的酶类，MMPs含量增高使ECM过度降解，削弱纤维帽的结构，促进血管平滑肌细胞的增殖、移行，影响损伤后血管重构等途径，使动脉粥样硬化斑块由稳定斑块向不稳定斑块转变，从而诱发斑块破裂，导致急性心脑血管事件的发生〔1〕。MMP-3又称基质溶解素-1，可激活MMP-1，MMP-8，MMP-9，使之由非活性的酶原转化为有活性的酶而起生物作用，并共同参与ECM的降解及斑块破裂的过程〔2，3〕，与AS形成以及斑块的破裂有密切关系。

ApoE基因敲除小鼠由于ApoE基因敲除后造成血浆含胆固醇丰富的残粒清除受阻，在短期内可模拟人类的AS病变发病〔4〕。应用ApoE基因敲除小鼠建立AS模型炎性反应明显，形成明确的不稳定斑块。其巨噬细胞、T细胞和平滑肌细胞的生理反应和人类心血管疾病中的反应极为相似〔5〕。

本研究显示，实验组血清MMP-3水平增高，在不稳定斑块中，脂质含量丰富，巨噬细胞增多，MMP-3的表达过量，证明了AS斑块的不稳定与MMP-3的表达增高密切相关及血清MMP-3水平升高有关〔6，7〕。而起修复作用的平滑肌细胞因老化凋亡等原因数量下降，ECM的合成与降解不平衡导致斑块易破裂。有研究显示，MMP-3在AS斑块的进程中起作用，而不是在心肌梗死急性期〔8〕，所以，MMP-3可作为急性心脑血管疾病的一个预测因子，对于MMP-3与AS斑块的研究值得更深入地探讨。

有研究认为，低密度脂蛋白升高可使斑块局部的MMP-3分泌增加，导致斑块不稳定〔1〕。所以降低低密度脂蛋白可以降低斑块内的MMP-3，起到稳定斑块的作用。另有研究发现他汀类药物有不依赖降脂作用的抑制MMPs的作用，有助于稳定斑块〔9〕。阿托伐他汀钙可显著降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白，本研究证实调脂治疗可使小鼠血清MMP-3水平下降，动脉斑块内MMP-3表达下降，阳性细胞百分比明显减少，动脉斑块缩小，从而起到抑制动脉硬化进展和稳定斑块的作用。

4参考文献

1Jones CB，Sane DC，Herrington DM.Matrix metalloproteinase：a review of their structure and role in acute coronary syndrome〔J〕.Cardiovasc Res，2003；59(4)：812-23.

2Newby AC.Dual role of matrix metalloproteinase(matrixins)in intimal thickening and atherosclerotic plaque rupture〔J〕.Physiol Rev，2005；85(1)：1-31.

3Sood RR，Taheri S，Caodelario-Jali E，etal.Early beneficial effect of matrix metalloproteinase inhibition on blood-brain barrier permeability as measured by magnetic resonance imaging countered by impaired long-term recovery after stroke in rat brain〔J〕.Cereb Blood Flow Metab，2008；28(2)：431-8.

4田枫，康爱君，张阔，等.载脂蛋白E基因敲除小鼠血小板与血脂及白细胞总数的关系〔J〕.中国老年学杂志，2006;26(10)：1392-3.

5Crisby M，Nordin-Fredriksson G，Shahp K，etal.Pravastain treatment increases collagen conetent and decreases lipid content inflammation，metalloproteinases，and cell death in human carotid plaques：implications for plaque stabilization〔J〕.Circulation，2001;103(7)：926-33.

6Ragino Jul，Cherniavskii AM，Polonskaia IV，etal.Inflammatory-destructive biomarkers of atherosclerotic plaques instability.Study of arterial wall and blood〔J〕.Kardiologiia，2010;52(5)：37-41.

7Moller MJ，Qin Z，Toursarkissian B，etal.Tissue markers in human atherosclerotic carotid artery plaque〔J〕.Ann Vasc Surg，2012;26(8)：1160-5.

8Samnegard A，Silveira A，Tornvall P，etal.Lower serum concentration of matrix metalloproteinase-3 in the acute stage of myocardial infarction〔J〕.J Int Med，2006;259(5)：530-6.

9Wilson SH，Herrmann J，Lerman LO，etal.Simvastatin preserves the structure of coronary adventitial vasa vasorum in experimental hypercholesterolemia independent of lipid lowering〔J〕.Circulation，2002;105(10)：415-8.

〔2015-01-07修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

〔中图分类号〕R543

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)12-2842-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.006

第一作者：刘莉(1972-)，女，主任医师，主要从事老年病研究。