大杯蕈组织分离部位的优选研究

黄先洲，林新坚

（1.宁德职业技术学院，福建福安　355000；2.福建省农业科学院土壤肥料研究所，福建福州　350003）

大杯蕈组织分离部位的优选研究

黄先洲1，林新坚2

（1.宁德职业技术学院，福建福安355000；2.福建省农业科学院土壤肥料研究所，福建福州350003）

为了确定大杯蕈组织分离的最佳部位，同时也为人工制种提供依据，对大杯蕈子实体4个不同组织分离获得的菌丝进行生长量、抗逆性和抗污染能力测定试验。经综合比较分析，结果表明，菌柄中上部组织是大杯蕈母种组织分离的最佳选择。

大杯蕈；组织分离部位；菌丝生长量；抗逆性；抗污染

0　引言

大杯蕈（Clitocybe maxima） 又名大杯伞，大漏斗菌，隶属于口磨科 （Trichlilmataceae），杯伞属（Clitocybe）［1］，味道鲜美、香味独特，是高温淡季丰富食用菌市场的珍稀菌类，有良好的发展前景。本试验对大杯蕈不同部位组织进行分离获得菌丝，并对其生长量、生长势，以及抗不良环境能力和抗杂菌污染能力进行了系列试验，以探求大杯蕈最佳的组织分离部位。

1　试验材料和方法

1.1供试菌株

新鲜大杯蕈优质子实体，无菌操作挑取子实体不同部位绿豆大小的内部组织，接入PDA试管培养基斜面中央，27℃下室温培养菌丝，纯化转管后分别获得A，B，C，D 4个供试菌株。

子实体分离部位选择与标记见图1。

1.2供试培养基

图1　子实体分离部位选择与标记

PDA培养基：马铃薯200 g，水1 000 mL，葡萄糖20 g，琼脂20 g［2］。

固体培养基：木屑39%，棉籽壳34%，麦麸22%，玉米粉3%，葡萄糖1%，轻质碳酸钙1%，含水量65%［3］。

1.3供试接种块置备

在PDA培养基灭菌后，取40 mL倒入250 mL的锥形瓶中，水平实验台自然冷却，凝固成PDA平板培养基，冷却后中央接种供试菌株，27℃室温培养14 d，统一在菌落外缘用直径5 mm打孔器打孔，获取无误差的供试接种块。

1.4不同组织分离部位的菌丝生长速度比较试验

1.4.1试验设计

单因素4个水平4个重复设计。即选用固体培养基，接种A，B，C，D 4种供试菌株，27℃室温培养，划线法测定菌丝生长量［4］。

1.4.2试验方法

将配制好的培养料称取42 g，等量填入25 mm× 200 mm试管内，共计20根。取略小于管口的小木棒统一向下压实4.5 cm，以保证每根试管内培养基有相同的松紧度。再抽出木棒，洗净管口，擦干，塞上棉花塞，置于手提高压锅中进行灭菌，压力为0.15 kPa，灭菌时间维持1 h。培养基冷却后，用大小一致、菌丝密度一致、菌龄一致的供试接种块接种，菌丝长满料面后划起始线，以后每隔3 d在菌丝先端划一次走菌线，测量15 d的走菌长度。

1.5不同部位组织分离菌株的生长势比较试验

试验设计、培养基制备与接种培养，方法与1.4相同，除对不同供试菌株生长量测定外，还比较了生长势。生长势是根据菌丝萌发的快慢、菌落生长的形态、菌丝生长的密度、色泽和均匀程度，按+++（优：表示菌丝生长整齐、纯白、浓密）、++（良：表示菌丝生长不齐、纯白、较密）、+（差：表示菌丝生长不齐、淡白、稀疏）三级标准进行直观评判。

1.6不同部位组织分离菌株的抗逆性比较试验

1.6.1试验设计

双因素试验，因素1设4个水平，即接种A，B，C，D 4种供试菌株；因素2也设4个水平，即选择21，24，30，33℃4种菌丝生长不良的温度条件，恒温培养菌丝；设置4个重复。划线法测定菌丝生长量。

1.6.2接种与培养

培养基制备、接种与生长量测定方法与1.4相同，将试管按设计要求分别放入21，24，30，33℃的恒温培养箱内培养。

1.6.3抗逆性评估

接种块萌发后继续恒温培养，主要根据大杯蕈菌株在各种逆境温度下的生长量，结合菌丝色泽、浓密程度等生长势差异，进行综合评价。

1.7不同部位组织分离菌株的抗污染试验

1.7.1试验设计

双因素试验，因素1设4个水平，即接种A，B，C，D 4种供试菌株；因素2也设4个水平，即细菌、链孢霉、青霉、绿色木霉4种染菌培养基；设置5个重复。划线法测定菌丝生长量。

1.7.2含杂菌培养基制备

先配制PDA培养基，各取25 mL等量分装25 mm×200 mm试管内，121℃灭菌30 min，水平放置于水平台上自然冷却，无菌操作下弃除前端1 cm的培养基；分别取2 mL细菌、链孢霉、青霉和绿色木霉悬浊液注入试管内，摇荡使其布满培养基表面，多余倒弃；用预先高压灭菌备用的无菌棉花塞替换被培养液湿润的棉花塞，制成含菌PDA试管平面培养基。

1.7.3抗污染能力评估

分别在含菌PDA试管平面培养基上接种大小一致、菌丝密度一致、菌龄一致的A，B，C，D菌株供试接种块，接种位置事先用记号笔划线定位，然后置于27℃的恒温箱中培养3 d，接种块萌发后继续恒温培养，根据大杯蕈菌株在各种含杂菌培养基上的生长速度、菌落大小、菌丝色泽、浓密程度等生长势和拮抗现象差异，划分4个不同评分等级，即4分（耐）、3分（较耐）、2分（一般）、1分（差），进行综合评价［3］。

2　结果与分析

2.1不同组织分离部位的菌丝生长速度比较试验

不同组织分离部位菌丝的生长量见表1。

表1　不同组织分离部位菌丝的生长量　/cm

不同部位组织分离的菌株菌丝生长量最大的是A菌株，其次是B，C菌株，D菌株最差。

组织分离母种菌丝生长量的方差分析见表2。

表2　组织分离母种菌丝生长量的方差分析

由表2可知，不同部位组织分离的菌株菌丝生长量存在显著差异。可见，大杯蕈母种组织分离部位的选择，对菌丝生长起着至关重要的作用。

4种不同部位的差异显著性（PLSD）法见表3。

由表3可知，A菌株与D菌株存在极显著差异，与B菌株存在显著性差异，与C菌株不存在显著差异；C菌株与B，D菌株存在显著性差异；B菌株与D菌株间不存在显著性差异。综上，A菌株即柄盖交界处组织分离母种生长量最大。说明在适宜的温度条件下，传统组织分离获得的菌株A表现效果最佳。

表3　4种不同部位的差异显著性（PLSD）法

2.2不同部位组织分离菌株的生长势比较试验

接种后第5天进行生长量、生长势作比较。

大杯蕈不同部位组织分离母种的结果统计见表4。

表4　大杯蕈不同部位组织分离母种的结果统计

由表4可知，在同批次试管的4个菌株中，以菌柄中上部内部组织分离的母种菌丝萌发较早，生长较快，菌丝生长势最强；柄盖交界处组织的生长速度最快，生长势次之。

2.3不同部位组织分离菌株的抗逆性比较试验

不同温度条件下不同组织部位的菌丝生长量见表5，菌株与温度因素见表6。

表5　不同温度条件下不同组织部位的菌丝生长量

根据试验统计结果，进行组织分离母种菌丝生长量的方差分析。

组织分离母种菌丝生长量的方差分析见表7。

表7　组织分离母种菌丝生长量的方差分析

F测验结果表明，不同菌株间、不同温度间菌丝生长量都达到极显著的水平，菌株×温度的菌丝生长量不存在差异，故需进行多重比较。

2.3.1菌株间和温度间菌丝生长量差异的显著性测验

菌株间和温度间菌丝生长量差异显著性测验见表8。

表8　菌株间和温度间菌丝生长量差异显著性测验

由表8可知，4个组织分离的菌株中B菌株与C，D，A菌株生长量差异均达到极显著水平；C菌株与A，D菌株生长量差异达到极显著水平；A菌株与D菌株不存在显著性差异。B菌株的菌丝生长量最高，C菌株的次之，A菌株的最低。由此可见，A菌株固然在适宜的温度27℃下生长量最大，但适应的温度范围窄；B菌株则对21，24，30，33℃等逆境温度均有较强的适应能力。

在4个温度处理中，4个温度间的菌丝生长量差异均达到极显著水平，但30℃的菌丝生长量最高，其次是24，21，33℃菌丝生长量最小。由此可见，大杯蕈菌株忍耐逆境高温的能力要比耐低温的能力弱，超过最适宜温度后，生长量下降幅度明显快于即B菌株对温度的抗逆性最强，菌株C次之，A菌株与D菌株最差。低于适宜温度后的下降幅度。

2.3.2不同部位分离的菌株在逆境温度下生长量差异显著性测验

各菌株在逆境温度下生长量差异显著性见表9。

综上所述，B菌株即菌柄中上部内部组织分离母种在4个温度条件下生长速度最快，生长势最佳。

表9　各菌株在逆境温度下生长量差异显著性

2.4不同部位组织分离菌株的抗污染试验

正常生长的大杯蕈菌丝纯白，气生菌丝较发达，先端生长整齐。侵染杂菌后，与杂菌接触部位或受侵染部分，大杯蕈菌丝均发生不同程度的色变，灰黄萎缩，失去原有特征。

2.4.1不同部位组织分离母种与绿色木霉的相互影响

绿色木霉侵染后，初期长出灰白色纤细的菌丝，生长缓慢。几天后，灰白菌落上出现淡绿色粉状分生孢子，菌落颜色由淡绿色转变为浓绿色，粉状层加厚，受污染的菌丝发黄。4个不同部位母种菌丝体在试管中覆盖绿色木霉菌落，二者不存在拮抗现象，但有逐渐被绿色木霉侵食的趋势。两者交界后第3天测其被侵食的平均长度值。

大杯蕈不同部位组织分离母种与绿色木霉的相互影响见表10。

表10　大杯蕈不同部位组织分离母种与绿色木霉的相互影响

2.4.2不同部位组织分离母种与青霉的相互影响

母种菌丝体受青霉侵染后的症状与绿色木霉相似。初期出现白色或黄白色绒状菌丝，1～2 d菌落便渐渐转变为绿色粉状霉层，局限生长。凡有青霉污染的地方，菌丝生长缓慢。4个不同部位母种菌丝在试管中覆盖青霉菌落，二者不存在拮抗现象，但有逐渐被青霉侵食的趋势。二者交界后第3天测其被侵食的平均长度值。

大杯蕈不同部位组织分离母种与青霉的相互影响见表11。

表11　大杯蕈不同部位组织分离母种与青霉的相互影响

2.4.3不同部位组织分离母种与链孢霉的相互影响

链孢霉侵染后，初期生出呈绒毛状的菌丝，其菌丝透明，有分枝和分隔且疏松，呈网状，无色、白色或灰色，生长后期呈粉红色、黄色。大量分生孢子堆集成团时，外观与猴头菌子实体相似。链孢霉的侵染能力比其他霉菌强，凡有链孢霉污染的地方几乎不生长。4个不同部位母种菌丝在试管中被链孢霉菌落覆盖，二者不存在拮抗现象，并有逐渐侵食的趋势。二者交界后第3天测其被侵食的平均长度值。

大杯蕈不同部位组织分离母种与链孢霉的相互影响见表12。

2.4.4不同部位组织分离母种与细菌的相互影响

细菌侵染后，主要是培养基表面覆盖一层黏液，生长后期并无明显的其他症状。4个不同部位母种菌丝在试管中覆盖细菌菌苔，继续生长，二者不存在拮抗现象。经过10 d的观察，通过划线法量取生长量，生长量取各试管算术平均值。

大杯蕈不同部位组织分离母种与细菌的相互影响见表13。

2.4.5综合评价

表12　大杯蕈不同部位组织分离母种与链孢霉的相互影响

表13　大杯蕈不同部位组织分离母种与细菌的相互影响

将上述4个不同组织部位母种对4种霉菌抗耐能力的得分分别统计，重复3次取算术平均值。A部位12.3分，B部位14.0分，C部位6.4分，D部位8.0分。以大于12分为好，8～12分为一般，小于7分为差，划分为3个类别。大于12分，即抗耐性比较好的有A，B部位；8～12分，即抗耐性一般的是D部位；小于7分，即抗耐性比较差的是C部位。结果研究认为，大杯蕈对杂菌是具有一定的抗御能力。

3　结论与讨论

（1）综合上述试验结果，认为选取成熟前大杯蕈子实体进行组织分离母种所选的4个部位中，B菌株即菌柄中上部内部组织分离母种效果最佳。主要是因为B菌株对21，24，30，33℃等逆境温度均有较强的适应能力，并且在生长势和抗污染方面都优于A菌株；而A菌株虽然在适宜的温度27℃下生长量最大，但适应的温度范围窄。由此可见，常规法取菌柄与菌盖交界处组织并非理想。

（2）在27℃温度条件下，A菌株菌丝的生长速度虽然快于B菌株，但在生长势、抗逆性、抗污染方面B菌株均优于A菌株，因此大杯蕈菌种栽培特性的早期评判，是以菌丝生长量为标准好，还是以菌丝生长势、抗逆性、抗污染等为标准好，是值得深入探讨的问题。本研究若有条件进一步进行出菇试验，将有助于澄清这一问题。

（3）陈明杰等人［5］认为，草菇组织分离物之间和出发菌株之间存在明显的遗传差异；王桂芹等人［6］认为，平菇不同部位组织分离物栽培特性的明显差异是由于低等生物组织细胞的隔膜上有大到足以让细胞质乃至多种细胞器移动穿过的隔孔，致使不同组织部位的细胞在大小、原生质浓度、细胞器数量、生理活性等方面都存在明显差异所致。大杯蕈菌柄组织纤维化程度高，细胞小，内含原生质浓度低、细胞器数量少、生理活性差，为何再生的菌丝生长更理想？这种情况在大杯蕈中有无普遍性，其他品种有无类似表现？这些问题均有待进一步研究。

［1］黄年来.中国食用菌百科 ［M］.北京：农业出版社，1993：119.

［2］黄毅.食用菌栽培 ［M］.第2版.北京：高等教育出版社，1998：217-228.

［3］暴增海，马桂珍.不同鸡腿蘑品种对霉菌抗耐能力的测定与分析 ［J］.中国食用菌，2001（2）：12-13.

［4］郝健，王永红.平菇组织分离母种优选部位试验初探 ［J］.延安大学学报（自然科学版），1999（4）：76-79.

［5］陈明杰，余智晟.草菇组织分离物的遗传变异研究（Ⅱ）［J］.食用菌学报，2000，7（2）：1-4.

［6］王桂芹，王秀艳.平菇子实体不同部位分离母种试验 ［J］.食用菌，2002，24（1）：15-16.◇

Study on the Best Separates Position of Clitocybe maxima Organization

HUANG Xianzhou1，LIN Xinjian2
（1.Ningde Vocational and Technical College，Fu'an，Fujian 355000，China；2.Soil and Fertilizers Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，Fujian 350003，China）

Test purpose lies in this study is to confirm the best separates position of Clitocybe maxima organization in order to offer artificially of making species.By culture of tissues separated from different four parts of Clitocybe maxima to make mother species，this study explored an experiment that against the bad environment and ability to resist pollution by measuring the growth volume of Clitocybe maxima's mycelium.Through comprehensive comparative analysis，the result indicates in four pieces of different position chosen，mother species separating from the top organization of the stem kind is the best choose.

Clitocybe maxima；separates position of organization；mycelium growth volume；against the bad environment；against pollution

S567.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.06.028

1671-9646（2016）06b-0005-05

2016-04-17

黄先洲（1982— ），男，硕士，讲师，研究方向为茶叶加工、食用菌。