食品微生物DNA能力验证样品的均匀性和稳定性研究

侯大海，刘云国，张　亮，徐云峰，刘凌霄

（1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐　830046；2.广东产品质量检验监督研究院，广东广州　510330；3.青州荣美尔生物科技有限公司，山东青州　262500；4.黄岛出入境检验检疫局，山东青岛　266000）

食品微生物DNA能力验证样品的均匀性和稳定性研究

侯大海1，2，*刘云国1，3，张亮3，徐云峰4，刘凌霄3

（1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046；2.广东产品质量检验监督研究院，广东广州510330；3.青州荣美尔生物科技有限公司，山东青州262500；4.黄岛出入境检验检疫局，山东青岛266000）

食品微生物DNA能力验证，是利用DNA检测方法，通过实验室间微生物检测结果的比对来确定实验室检测能力的活动。以沙门氏菌（Salmonella）基因组DNA为测试目标，开展了实验室间食品微生物DNA检测能力验证样品的制备，研究了DNA检测能力验证中样品的均匀性和稳定性，以期为食品微生物DNA能力验证的运作提供指导。

食品微生物；DNA能力验证；均匀性；稳定性

实验室能力验证，是通过实验室间检测结果的比对来确定实验室能力的活动。通过持续地开展实验室能力验证活动，可以有效地提高实验室的品质控制能力和检测水平，并提高检测结果的可靠性和权威性［1］。同时，为科研工作以及政府管理工作提供科学、客观的信息。常规微生物能力验证，通常指寄送含或不含目标测试菌盲样时的验证能力。由于可能存在致病微生物，常规微生物能力验证方式在检测样品的运输、储存、检测时，存在较大的生物安全隐患。实验室能力验证活动中采用灭活的微生物，通过提取DNA进行检测的方法可消除这种危险。因而研究食源性致病微生物时，DNA检测能力验证的运作极其重要。能力验证计划中的样品制备不同于一般检测样品的制备，除保证样品具有代表性和可靠性外，还应考虑样品的均一性和稳定性［2］。基于以上能力验证规则的要求，本文研究了沙门氏菌（Salmonella）DNA样品能力验证中的均匀性和稳定性试验。

1　材料与方法

1.1沙门氏菌的培养和制备

沙门氏菌菌株，来源于美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC）。沙门氏菌标准菌株（ATCC 49416）经活化后，挑取单菌落接种到含有200 mL的TSBYE三角瓶中大量培养，以转速10 000 r/min离心5 min收集沉淀，加入双蒸水重新悬浮，水浴灭活后，分装到Eppendorf管中冻干制样［3］。

1.2均匀性试验

若F＜自由度为（v1，v2） 及给定显著性水平α（通常α=0.05）的临界值 Fα（v1，v2），则表明样品内和样品间无显著性差异，因而样品是均匀的。

1.3稳定性试验

采用室温条件下的储存温度（20℃），进行稳定性试验。样品制备完毕后间隔15 d，从沙门氏菌阳性样品中各随机抽取6份样品，进行荧光定量PCR检测。采用2个样本均数显著性检验-t检验进行统计分析。

自由度df=2（n-1）

若|t|＜自由度为2（n-1）给定显著性水平α（α= 0.05）的临界值t0.05［2（n-1）］，则表明2次检测结果无显著性差异，因而样品是稳定的。

2　结果与分析

2.1均匀性试验

（1）样品A为沙门氏菌阳性样品。随机选取A样品6个，进行荧光定量PCR检测，结果与已知本底结果相吻合，说明均为阳性。CT值的平均值为14.75。

（2）样品B为沙门氏菌阴性样品。经随机选取B样品6个，进行荧光定量PCR检测，结果与已知本底结果相吻合，说明结果均为阴性。

沙门氏菌阳性样品的均匀性试验结果（荧光定量PCR CT值）见表1，沙门氏菌样品均匀性试验方差分析结果见表2。

表1　沙门氏菌阳性样品的均匀性试验结果（荧光定量PCR CT值）

表2　沙门氏菌样品均匀性试验方差分析结果

F临界值F0.05（5，6）=4.387，计算的F值为0.106 4，该值＜F临界值，无显著性差异，这表明样品中沙门氏菌含量均匀。

沙门氏菌均匀性试验荧光定量PCR扩增曲线见图1。

图1　沙门氏菌均匀性试验荧光定量PCR扩增曲线

2.2稳定性试验

沙门氏菌阳性样品稳定性试验结果（荧光定量PCR CT值）见表3。

表3　沙门氏菌阳性样品稳定性试验结果（荧光定量PCR CT值）

由表3可知，沙门氏菌阳性样品第1次检测的平均值结果为14.73，室温条件下放置15 d后第2次检测的平均值结果为14.93。

沙门氏菌阳性样品稳定性试验结果见表4。

表4　沙门氏菌阳性样品稳定性试验结果

t临界值t0.05（10）=2.228，计算所得|t|值＜t临界值，无显著性差异，这表明沙门氏菌样品的稳定性良好。

沙门氏菌稳定性试验荧光定量PCR扩增曲线见图2。

图2　沙门氏菌稳定性试验荧光定量PCR扩增曲线

3　结论与讨论

本次沙门氏菌DNA能力验证要求利用基于DNA技术的分子生物学手段进行检测，试验结果表明DNA样品符合均匀性和稳定性的要求。实验室间食源致病微生物DNA检测能力验证提供的沙门氏菌检测样品已经灭活，目的是消除能力验证活动中食源致病微生物在运输、储存、检测过程中的生物安全隐患。本次能力验证活动的样品在制备、保存、运输、安全性等技术指标上均能达到实验要求。本研究以CNAS-RL02∶2011能力验证规则、CNASPD21∶2011能力验证工作程序、CNAS-CL03∶2010能力验证计划提供者认可准则、ISO/IEC导则43-1∶1997利用实验室间比对的能力验证-能力验证计划的建立和运作、CNAS-CL04∶2010标准物质/标准样品生产者能力认可准则等规则为基础，结合食源致病微生物检测实验室的特点，通过对样品均匀性、稳定性等关键技术的研究，旨在建立一个与国际规范接轨、操作性强的食品微生物能力验证关键技术规范。

［1］中国实验室国家认可委员会.ISO/IEC 17025∶2005检测和校准实验室能力的通用要求 ［S］.北京：中国标准出版社，2005.

［2］中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL02∶2014能力验证结果的统计处理和能力评价指南 ［S］.北京：中国标准出版社，2014.

［3］中华人民共和国卫生部.GB 4789.4—2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验 ［S］.北京：中国标准出版社，2010.◇

Study on Uniformity and Stability of Food Micro-organism DNA Proficiency Testing

HOU Dahai1，2，*LIU Yunguo1，3，ZHANG Liang3，XU Yunfeng4，LIU Lingxiao3
（1.College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi，Xinjiang 830046，China；2.Guangdong Testing Institute of Product Quality Supervision，Guangzhou，Guangdong 510330，China 3.Qingzhou Ronmer Biology Technology Co.，Ltd.，Qingzhou，Shandong 262500，China；4.Huangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao，Shandong 266000，China）

Food micro-organism DNA proficiency testing is to determine the testing capacity by inter-laboratory testing results using DNA testing method.This study organized DNA proficiency testing of food micro-organism using genomic DNA of Salmonella as the test objective.The uniformity and stability of food micro-organism DNA samples are studied in order to provide guidance for the operation of DNA proficiency testing.

food micro-organism；DNA proficiency testing；uniformity；stability

R378

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.06.033

1671-9646（2016）06b-0022-03

2016-05-08

新疆大学自治区天山学者科研启动金资金项目（45030）；新疆自治区高层次人才引进工程专项经费项目（45049）。

侯大海（1976— ），男，硕士，质量工程师，研究方向为食品加工。
*

刘云国（1977— ），男，博士，教授级高级工程师，硕士生导师，研究方向为食品生物技术。