1株具有抗肝癌活性的狭叶柴胡内生真菌的鉴定

程玉鹏，李天聪1，周永强1，林进华1，陈琦1，马爱萍1，李弘琨1



1株具有抗肝癌活性的狭叶柴胡内生真菌的鉴定

程玉鹏1，2，李天聪1，周永强1，林进华1，陈琦1，马爱萍1，李弘琨1

（1.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨150040；2.哈尔滨师范大学 生命科学与技术学院，黑龙江哈尔滨150024）

摘要：目的对1株具有抗肝癌活性的狭叶柴胡内生真菌CHS4进行菌种鉴定，并对其抗肝癌活性进行初步检测。方法采用传统分类学方法及电子显微镜观察对CHS4进行形态鉴定，并采用真菌鉴定通用引物V9D与LS266对其基因组DNA进行扩增得到ITS序列，将已经测得的序列结果与GenBank中已知序列进行Blast分析，从而进行分子鉴定。利用MTT法对菌CHS4的乙醇粗提物进行抗肝癌活性检测。

结果内生真菌CHS4经鉴定为链格孢属真菌互隔交链孢霉（Alternaria alternata）；该菌株发酵液的乙醇粗提物对肝癌细胞HepG-2的抑制作用与其浓度成正相关，且IC50值为75.11 μg/mL。结论从狭叶柴胡中分离到一株具有抗肝癌作用的内生真菌CHS4，可作为生产抗肝癌药物的候选资源。

关键词：狭叶柴胡；内生真菌；菌种鉴定；抗肝癌活性

网络出版时间：2016-05-23 11：10 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160523.1110.003.html

内生真菌是指在其生活史的部分或全部阶段生存在植物体内而不引起明显感染症状的真菌［1-2］，在与宿主植物共同进化的过程中，其次生代谢产物十分丰富，具有多种药理作用［3-5］。柴胡属（Bupleurum L.）植物是伞形科（umbelliferae）植物中的大属之一，《中国药典》规定柴胡或狭叶柴胡为正品［6］。近代药理研究表明，柴胡具有抗感染、抗病毒、调节免疫、降血脂及抗肿瘤等功效［7］。自1993年，具有产紫杉醇能力的内生真菌被发现后，利用植物内生真菌生产药效活性物质引起了人们的广泛重视［8］。而内生真菌在发酵过程中，具有周期短、易生长的特性，因此对内生真菌产活性物质的深入研究具有十分重要的意义。在前期工作中，本课题组从狭叶柴胡中分离得到1株内生真菌CHS4，本文对该菌株进行了形态学鉴定以及分子鉴定，并对其抗肝癌活性进行了初步研究，为后续活性产物的分离纯化研究提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

菌株来源：狭叶柴胡内生真菌 CHS4由黑龙江中医药大学药学院生物技术实验室分离并保藏。

细胞来源：肝癌细胞HepG-2购买自ATCC细胞库，由黑龙江中医药大学药学院生物技术实验室传代保种。

1.2 培养基

马铃薯蔗糖（琼脂）培养基：包括质量浓度分别为20%的马铃薯，2%的蔗糖，1.2%的琼脂。将马铃薯洗净去皮，切成小块，加入适量水煮沸15 min，八层纱布滤过，向滤液中加入蔗糖，搅拌以加速蔗糖溶解，定容（固体培养基还需加入质量分数1.2%的琼脂），121℃灭菌20 min。

1.3 仪器

PH-71电热恒温培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；FA1204B电子天平（上海精科天美科学仪器有限公司）；RT-6000酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；Milli-Q Biocel超纯水仪（美国Millipore公司）；FL-30系列生物显微镜（江西枫林光学仪器有限公司）；JY-SPCT水平电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司）；Bio-Rad T100TMThermal Cycler（美国Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 菌株的形态学鉴定

根据《真菌鉴定手册》［9］方法，采用菌落形态观察法和显微结构观察法对CHS4进行鉴定。接种于PDA固体平板上的菌落，观察培养基中菌落的大小、颜色、菌落表面的纹饰、边缘的形态与生长情况。插片培养的菌丝在电子显微镜下观察有无分生孢子梗，产孢结构的形态特征，分生孢子的大小、形状及聚集方式等。

2.2 菌株的分子鉴定

2.2.1 基因组DNA的提取与检测 采用液氮研磨法提取真菌基因组DNA［10］，用适量去离子水溶解，-20℃保存。取少量模板DNA，分光光度法测定A260/A280的值，以确定模板纯度及计算DNA的浓度。采用1×TAE作为电泳缓冲液，质量分数0.8%琼脂糖凝胶电泳检测真菌基因组DNA模板，加样量为5 μL，电压120 V，电泳时间30 min。紫外灯下检测真菌基因组DNA提取结果。

2.2.2 PCR扩增 采用真菌鉴定通用引物V9D与LS266［11］，对内生真菌进行 ITS序列扩增。引物由上海生物工程有限公司进行合成。引物 V9D（5′-TTAAGTCCCTGCCCTTTGTA-3′）；引物 LS266（5′-GCATTCCCAAACAACTCGACTC-3′）。

反应体系：10×PCR Buffer with MgCl27 μL，dNTP（2.5 mmol/L）10 μL，引物各2 μL，模板DNA 2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.35 μL，加ddH2O 至50 μL。

PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸 10 min。反应结束后，取扩增产物5 μL，经质量分数0.8%琼脂糖凝胶电泳，鉴定目的条带与预期大小是否相符。

2.2.3 PCR扩增产物的序列测定与数据处理 将PCR扩增片段送上海生物工程有限公司进行测序，以V9D、LS266为引物双向测序。将已经测得的序列结果与GenBank中已知序列进行Blast分析，再从Genbank数据库中获取相关菌的种属的ITS序列信息，应用MEGA 5.0软件构建系统进化树。

2.2.4 抗肝癌活性的检测 从保存在PDA斜面培养基的内生真菌中挑取菌丝，接种于装有100 mL马铃薯蔗糖液体培养基的250 mL三角瓶中，25℃黑暗条件下，静置发酵培养12 d。将得到的菌体烘干，称定质量，按照60 mL/g干菌体的比例加入体积分数70%乙醇回流提取2次，每次2 h，滤过，合并滤液，50℃挥干乙醇，备用。

采用体外测定细胞毒活性的MTT（溴化四氮唑蓝）法［12］，以阿霉素作为阳性药，在570 nm波长下测定吸光度（A），按下列公式计算对肝癌细胞HepG-2的生长抑制率（I）：

I=（A对照组-A试验组）/A对照组×100%。

3 结果与分析

3.1 CHS4菌株的鉴定

3.1.1 菌株的形态学鉴定结果 利用点植法在PDA固体培养基上28℃培养CHS4，可得到单一菌落，菌落生长迅速、平整，等径生长，边缘整齐。起初菌落为白色或灰白色，由于菌丝体产生色素，能够扩散到培养基中，之后渐渐转变为深色，菌落呈灰黑色，菌落背面为黑色。插片法可观察到菌丝多细长，分枝分隔。可见分生孢子，横隔明显，结果见图1。对照《真菌鉴定手册》［9］及《链格孢属真菌现代分类方法研究》［13］将 CHS4初步归属为链格孢属（Alternaria）。

A.内生真菌CHS4的菌落形态；B.菌丝形态；C.分生孢子。图1 内生真菌CHS4的形态Figure 1 The morphology of endophytic fungus CHS4

3.1.2 菌株的分子鉴定结果 由图2可以看出，内生真菌的DNA模板在2.3 kb的位置有一清晰条带，且无拖尾现象，证明所得基因组DNA完整，符合进行下一步PCR扩增条件。PCR电泳结果显示，样品ITS序列的PCR扩增产物在约900 bp左右的位置有清晰条带，分子质量大小范围与文献［14］所述一致，且无其他杂质存在，证明所得PCR产物为预期产物。PCR产物经测序，得到扩增产物序列长度为920 bp，该序列包括部分18S序列，全部ITS1、5.8S、ITS2序列和部分28S序列，将所得序列提交至美国国立生物技术信息中心（NCBI），进行Blast比对后构建系统进化树，并提交测序结果获得菌株CHS4GenBank登陆号为KJ082099。

选取GenBank中与KJ082099的ITS序列同源性高的系列菌株用于系统发育分析，结果表明与CHS4相似性较高的序列主要分布在链格孢属。由图 3可见，CHS4（KJ082099.1）与 GU797144.1 （Alternaria alternata）聚类在同一分支，组成一个单系类群（monophyletic group），亲缘关系最为相近，其同源性达到99%，故可判断该菌株为链格孢属真菌互隔交链孢霉（Alternaria alternata）。

3.2 抗肝癌活性检测

把内生真菌CHS4的乙醇粗提物依次以5个不同质量浓度（0.04、2、10、50、100 μg/mL）进行给药，选用广谱抗肿瘤药阿霉素作为阳性药，分别测定各物质对肝癌细胞HepG-2的抑制率，结果见图4。可见，菌株CHS4发酵液的乙醇粗提物具有一定的抗肝癌作用，且对肝癌细胞HepG-2的抑制作用与其质量浓度成正相关，IC50值为75.11 μg/mL。

A.基因组DNA；B.PCR扩增产物。M.DNA Marker；1、2.基因组DNA；K.空白对照；P.PCR扩增产物。图2 基因组DNA及PCR扩增产物电泳图片Figure 2 　Electrophoresis of genome DNA and PCR amplification product

图3　根据ITS序列用MEGA5.0软件生成的系统进化树Figure 3 The phylogenetic tree generated by ITS sequences analysis using MEGA5.0 program

A.阳性药阿霉素；B.CHS4乙醇粗提物。图4 阿霉素和CHS4乙醇粗提物对肝癌细胞HepG-2的抑制率Figure 4 The inhibition rate of positive drug doxorubicin and crude ethanol extracts of CHS4 on HepG-2 cells

4 讨论

研究表明，柴胡具有抗肿瘤的药理作用［15］。本研究对分离自狭叶柴胡内生真菌的抗肝癌活性进行初步检测，结果表明内生真菌CHS4具有一定的抗肝癌作用。在自然条件下，内生真菌与宿主植物能够协同进化［16］。目前推测，可能由于基因的重组或二者之间长期进行信息交流，使得内生真菌获得与宿主相同的代谢通路［17］，从而使内生真菌具有产出与宿主植物相同或相似活性成分的能力，进而具有与宿主植物相同的药理作用［8］。这为利用内生真菌大规模发酵生产药理活性物质奠定了前期理论基础。

在传统的真菌鉴定方面，一直都是以形态特征为主要鉴定标准，而形态特征易受营养基质和温度、湿度、光、pH等条件的影响，有时候可能会难于准确鉴定，具有一定的弊端。ITS序列分析能够在分子水平给出菌株的相关属、种的鉴定分离信息，并可选取同源性高的系列菌株进行系统发育树的构建，具有一定的准确性。应用ITS序列进行系统发育树的构建对菌株鉴定及真菌多样性的研究来说不失为一种强有力工具，其快速准确的优点对于鉴定特征不明显和难于培养的菌株来说更有意义。

据报道，链格孢属是全球分布最广，经济上重要的半知菌类真菌之一［18］。某些链格孢种高产纤维素酶是具有应用潜力的生物资源［19］。除此之外，作为植物内生真菌的链格孢可产生喜树碱、紫杉醇等抗癌药物［20-21］。本研究中的狭叶柴胡内生真菌CHS4具有抗肝癌活性的结果也与这一理论基本符合，但其抗肝癌的活性成分还需进一步分离。在今后的研究中，将深入对其抗肝癌的活性部位进行筛选及分析，为进一步分离得到其抗肝癌的活性成分及研究其抗肝癌的作用机制提供一定的依据。

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（责任编辑：陈翔）

中图分类号：R284.1

文献标志码：A

文章编号：1006-8783（2016）03-0286-05

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016030901

收稿日期：2016-03-09

基金项目：国家自然科学基金项目（81573539）；黑龙江省自然科学基金项目（H2015042）

作者简介：程玉鹏（1966—），男，副教授，硕士研究生导师，主要从事中药生物技术的研究工作，Email：yupengcheng@msn.com。

Identification of an endophytic fungus of Bupleurum scorzonerifolium Willd.with anti-hepatoma activity

CHENG Yupeng1，2，LI Tiancong1，ZHOU Yongqiang1，LIN Jinhua1，CHEN Qi1，MA Aiping1，LI Hongkun1
（1.School of Pharmacy，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China；2.School of Life Science and Technology，Harbin Normal University，Harbin 150024，China）

AbstractObjective To identify an endophytic fungus of Bupleurum scorzonerifolium Willd.with antihepatoma activity and study its anti-hepatoma activity as well.Methods By using the traditional taxonomic methods the identification of morphological characters were performed.Primers V9D and LS266 were used to amplify the ITS sequence from genome DNA of CHS4.The amplified sequence was compared with known sequences in Blast of NCBI.Anti-hepatoma activity was detected by MTT assay.Results Fungus CHS4 from B.scorzonerifolium Willd. was classified as Alternaria alternate by the morphology and ITS identification. The ethanol crude extract of CHS4 had the ability to inhibit HepG-2 cell growth.There was a positive correlation between inhibition effect and concentration and IC50value was 75.11 μg/mL.Conclusion The strain CHS4 with anti-hepatoma activity can be regarded as alternative resource for producing anti-hepatoma drugs.

Key wordsBupleurum scorzonerifolium Willd. endophytic fungi strain identification anti-hepatoma activity