SPG膜乳化法制备PEG-PLGA微球和PLGA微球载药释药特性的对比研究

钟晨，罗宇燕，郭喆霏，罗永梅，张永明



SPG膜乳化法制备PEG-PLGA微球和PLGA微球载药释药特性的对比研究

钟晨1，罗宇燕2，郭喆霏2，罗永梅1，张永明2

（1.中山大学 药学院，广东 广州 510006；2.中山大学附属第三医院 药剂科，广东 广州510630）

摘要：目的采用SPG膜乳化法，研究制备载蛋白药物的PEG-PLGA微球的新工艺，并比较PEG-PLGA微球和PLGA微球的载药释药特性的差异。方法以多种PEG-PLGA为载体材料，牛血清白蛋白（BSA）为模型药物，采用SPG膜乳化法制备缓释微球；以载药量、包封率、体外释放、粒径等为指标，优化载体材料种类、司盘80用量等参数；采用激光共聚焦显微镜、差示扫描量热法等方法探讨PEG-PLGA微球和PLGA微球的载药释药差异的机制。结果 优化的 PEG-PLGA微球形态圆整、粒径均一，平均粒径（42.89±0.21）μm，包封率和突释率分别为91.40%、16.23%，40 d累积释放率超过90%。结论PEG-PLGA缓释微球能有效提高载药量、包封率，降低突释率，释药匀速且完全。

关键词：PEG-PLGA；PLGA；SPG膜乳化法；缓释微球

网络出版时间：2016-05-19 9：45 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160519.0945.001.html

利用生物可降解的PLGA将蛋白多肽类药物制成微球注射剂，可解决这类药物稳定性差、口服易降解、需频繁长时间注射给药等缺点［1-2］。但PLGA作为载体材料存在药物突释严重，后期几乎不释药以及释药不完全等问题［3-4］，添加致孔剂、调整处方工艺参数均无较大改善。PEG-PLGA由于材料亲水性的增加，能显著改善释药性能，药物释放匀速且完全，并且能最大限度保护蛋白药物的活性［5］。SPG膜（shirasu porous glass membrane）是日本SPG公司开发的新型无机膜，膜孔径微小、均匀且可控。SPG膜乳化法原理是分散相在N2压力的作用下透过微孔膜的膜孔而在膜表面形成液滴，在沿膜表面流动的连续相的冲洗作用下，液滴的直径达到临界值后，就从膜表面剥离，从而形成乳液。SPG膜乳化法与传统乳化技术比较，具有能耗低、反应条件温和、乳滴粒径均一可控、操作简便等优点。

本研究采用SPG膜乳化法，以PEG-PLGA为载体材料制备包载牛血清白蛋白（BSA）的缓释微球，以载药量、包封率、粒径、体外释药行为等作为评价指标来进行处方工艺筛选，并对比PEG-PLGA和PLGA 2种载体材料的载药释药特性的差异，探讨释药影响机制，为PEG-PLGA应用于蛋白类药物缓释微球奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

MG-20外压式 SPG膜乳化器（日本 SPG公司）；T25高速匀浆器（美国IKA公司）；JSM-6330F冷场扫描电镜（日本电子公司）；SL16/40（R）冷冻离心机（美国Thermo公司）；Mastersizer2000激光粒度仪（英国马尔文仪器有限公司）；CLSM710激光共聚焦显微镜（德国Zeiss公司）；SDC214差示扫描量热仪（德国Netzsch公司）；Eon全自动酶标仪（美国Bio-Tek公司）。

1.2 试药

牛血清白蛋白（BSA，美国Genview公司）；异硫氰酸荧光素牛血清白蛋白（FITC-BSA，美国Sigma公司）；PEG-PLGA（济南岱罡生物工程有限公司）；PLGA（美国伯明翰公司）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Pierce公司）。

2 方法

2.1 微球的制备

采用外压式SPG膜乳化装置，结合W1/O/W2复乳溶剂挥发法制备微球［6］。

PEG-PLGA微球的制备：称取药物粉末，加入适量泊洛沙姆188（F68）溶液充分溶解作为内水相。PEG-PLGA（部分处方加入司盘80作为油相乳化剂）溶解于二氯甲烷作为油相。在冰浴条件下高速匀浆制成初乳。再将初乳作为分散相转移至SPG膜乳化器的储罐内，通过N2压力的作用透过SPG膜的膜孔，进入连续相从而形成复乳。低温条件下低速搅拌3 h使微球固化完全，离心收集，纯化水洗涤3次后冷冻干燥，即得。

PLGA微球的制备：除油相不加司盘80外，其余步骤同“PEG-PLGA微球的制备”。

2.2 微球载药量和包封率的测定

精密称取PEG-PLGA载药微球和PLGA载药微球约10 mg，置于7 mL离心管中，加入0.1 mol/L NaOH-质量分数2%SDS溶液5.0 mL［7］，置37℃恒温水浴摇床内匀速振摇48 h，使微球完全裂解，13 000r/min离心5 min后，取上清液进行BCA法蛋白含量测定。同法处理 PEG-PLGA空白微球和PLGA空白微球的裂解液作为背景校正。载药量和包封率分别按以下公式计算：载药量=微球中含药量/微球总质量×100%，包封率=实际载药量/理论载药量×100%。

2.3 微球的体外释放情况

精密称取PEG-PLGA载药微球和PLGA载药微球约 50 mg，加入 10 mmol/L pH7.4缓冲液1.5 mL［7］，置于37℃恒温水浴摇床中，以100 r/min匀速振摇，分别于5、10 h，1、2、4、7、10、15、20、25、30、35、40 d取出，5 000 r/min离心5 min，将上清液全部取出，加入新鲜的PBS。用BCA法测定上清液蛋白含量，同法处理PEG-PLGA空白微球和PLGA空白微球作为背景校正，计算不同时间点的蛋白释放量。

2.4 微球的理化性质表征

将PEG-PLGA微球均匀分散在导电胶上，置于真空条件下，喷上金粉，利用冷场发射扫描电子显微镜（SEM）在电子束强度为10 kV的条件下观察微球的形态。采用激光粒度分析仪干法测定微球的粒径及粒度分布情况。采用差示扫描量热仪（differential scanning calorimetry，DSC）考察微球的相转变温度（Tg），分别称取5 mg的BSA粉末、空白微球、空白微球与BSA的物理混合物以及载药微球，在10～160℃范围内，以N2为载气，以10℃/min的速度升温，记录曲线。

2.5 微球内部药物的分布

将2种载体材料制备的载荧光蛋白FITC-BSA微球分别均匀分散在培养皿中，采用激光共聚焦显微镜（CLSM）来观察微球内部药物分布的差异。固定吸收波长为488 nm，激发波长为525 nm，放大倍数为100倍。

3 结果与讨论

3.1 PEG-PLGA微球的处方优化

3.1.1 PEG-PLGA种类对微球质量的影响 本课题组前期以PLGA为载体材料，采用SPG膜乳化法制备缓释微球并进行了处方筛选，确定优化处方为：理论载药量11.11%，聚合物质量分数15%，内水相300 μL，初乳匀浆转速15 000 r/min，SPG膜孔径5 μm，膜挤出压力30 kPa。但研究过程中发现，微球突释严重且仍存在释药停滞等问题。新型嵌段共聚物PEG-PLGA以疏水性的PLGA和亲水性的PEG为主要组成成分，具有两亲性，可增强与蛋白药物的相容性而改善其载药释药性能［5］。通过调节聚合方式、PEG分子量、PLGA分子量、乙交酯-丙交酯（LA-GA）比例等可获得不同性能及用途的嵌段共聚物材料［8］。

本文选取6种共聚物（表1）作为载体材料（其中PLGA的LA∶GA的质量比均为50∶50），按“2.1”项处方工艺制备微球，以筛选合适的载体材料，结果见表1。可见，PEG2千-PLGA2.8万和PEG2千-PLGA3.8万2种载体材料的载药量和包封率较高，可能是这2种材料的PEG分子量占比（5%～10%）较适中［9］，使聚合物材料亲水性增强，但对PLGA的包封性能影响不大。PEG5千-PLGA2.8万则由于引入了较长的亲水链而弱化了PLGA的包封性能，导致载药量、包封率显著降低，突释明显增强。PLGA5万-PEG6千-PLGA5万虽然PEG分子占比合适，但由于三嵌段共聚物黏度增强，相同初乳匀浆转速下乳化效果减弱，且膜通量降低，导致包封率降低、粒径分布变宽。

另外，PEG2千-PLGA2.8万和PEG2千-PLGA3.8万的体外释放行为差异也较大（图1），前者突释比后者严重，从40 d累积释放率来看，前者累积释放超过80%，而后者不到50%，且5～20 d期间释药几近停滞。可能原因是后者PLGA分子量增加，黏度增大，降解减缓导致释药减缓。但是，据文献［10］报道，在体内由于酶降解等微环境因素会加速释药，可能会影响其体内释药行为，需进一步探讨二者的体内释药规律。

综合以上分析，以PEG2千-PLGA2.8万作为载体材料进行下一步研究。

表1　PEG-PLGA种类对微球性质的影响Table 1 The effect of PEG-PLGA species on the properties of microspheres（±s，n=3）

表1　PEG-PLGA种类对微球性质的影响Table 1 The effect of PEG-PLGA species on the properties of microspheres（±s，n=3）

载体材料　　载药量/%　　包封率/%　　突释率/%　　粒径/μm PLGA2万-PEG6千-PLGA2万　5.78±0.56　52.06　76.95±1.69　134.55±0.32 PLGA5万-PEG6千-PLGA5万　6.62±0.23　59.63　0.73±0.33　118.36±0.30 PEG2千-PLGA1.8万　5.38±0.44　48.44　48.29±1.10　102.28±0.27 PEG2千-PLGA2.8万　7.97±0.03　71.77　30.53±1.86　69.45±0.21 PEG2千-PLGA3.8万　8.18±0.18　73.67　9.94±1.08　58.69±0.27 PEG5千-PLGA2.8万　3.99±0.66　35.91　55.01±2.35　124.83±0.31

图1　PEG-PLGA种类对微球体外释放的影响Figure 1 The effect of different kinds of PEG-PLGA on the release from microspheres（n=3）

3.1.2 司盘80用量对微球质量的影响 试验中发现，将载体材料改为PEG-PLGA，初乳乳化效果变差，而初乳作为热力学不稳定体系，乳化效果差会直接导致药物流失，降低包封率［11］。为改善初乳的乳化效果，结合处方工艺的特点，选择W/O型乳化剂司盘80与PEG-PLGA共溶于二氯甲烷作为油相使用。

以PEG2千-PLGA2.8万作为载体材料，司盘80的用量分别为0、25、50 mg，其余按“2.1”项处方工艺制备微球，以筛选合适的司盘80用量，结果见表2。可见，加入司盘80后初乳乳化效果显著改善，外观乳白细腻。当司盘80的用量为25 mg时，载药量、包封率增大，突释率降低，微球粒径减小且分布变窄。这是由于乳化剂在W1/O界面上吸附形成一定强度的界面膜，抑制内水相液滴间发生合并，并且由于降低了界面张力，在相同的匀浆转速的情况下，内水相W1更容易被分散为小的乳液粒子，提高体系的稳定性，减少内水相药物渗出。但是，继续增大司盘80的用量（50 mg）反而引起包封率下降，可能原因是过多的表面活性分子无法接触到内水相，不能发挥作用而成为油相的一部分，不均匀地分散在油相中，增大体系的黏性，使得内水相不易被分散为微小的乳液颗粒，挤出形成复乳时易粘连，导致粒径分布变宽。

体外释放行为（图2）显示，加入适量司盘80对40 d累积释放率不产生影响；当用量过大（50 mg）时，则显著延缓药物的释放，40 d累积释放率不足50%，原因可能是因为多余的司盘80溶解于油相中，增大了疏水性而阻滞药物释放。

综合以上分析，司盘80用量在25 mg时效果最佳。载药量为10.15%、包封率为91.40%、平均突释率为16.23%、平均粒径为（42.89±0.21）μm；40 d累积释放率超过90%，整个释放周期以较均匀的速度持续释放；微球形态光滑圆整、粒径均一且分散性良好。

表2　司盘80用量对微球性质的影响Table 2 　The effect of various amount of Span80 on the properties of microspheres（±s，n=3）

表2　司盘80用量对微球性质的影响Table 2 　The effect of various amount of Span80 on the properties of microspheres（±s，n=3）

司盘80用量/mg载药量/%包封率/%突释率/%粒径/ μm 0　5.86±0.42　52.77　32.53±2.06 71.74±0.39 25　9.64±0.12　86.76　15.05±0.63 41.28±0.19 50　6.79±0.27　61.15　11.01±1.03 54.36±0.27

图2　司盘80用量对微球体外释放的影响Figure 2 The effect of various amount of Span80 on the release from microspheres（n=3）

最终确定 PEG-PLGA微球的优化处方为：PEG2千-PLGA2.8万为载体材料，司盘 80用量为 25 mg，其他参数同“3.1.1”项。

表3　优化处方制备PEG-PLGA微球的性质Table 3 Characteristics of PEG-PLGA microspheres preparedby modified prescription（±s，n=3）

表3　优化处方制备PEG-PLGA微球的性质Table 3 Characteristics of PEG-PLGA microspheres preparedby modified prescription（±s，n=3）

批号　　载药量/%包封率/%突释率/%粒径/ μm 20150901 10.17±0.66　91.51　14.42±0.18　44.51±0.20 20150902 10.01±0.13　90.14　15.96±1.05　42.30±0.21 20150903 10.28±0.25　92.54　18.29±0.32　41.87±0.21

图3　优化处方制备的PEG-PLGA微球的体外释放曲线Figure 3 In vitro release of PEG-PLGA microspheres prepared by modified prescription（n=3）

a.SEM图（1 600×）；b.SEM图（100×）；c.粒径图。图4 优化处方制备的PEG-PLGA微球的SEM和粒径分布图Figure 4 　SEM and diameter distribution pictures of PEGPLGA microspheres prepared by modified prescription

3.3 PEG-PLGA微球和PLGA微球的比较

3.3.1 载药释药性能的比较 PEG-PLGA微球和PLGA微球的载药性能比较结果见表 4。可见，PEG-PLGA作为载体材料能显著提高载药量、包封率，并降低突释率，微球粒径缩小且粒径更加均一。PLGA微球和PEG-PLGA微球的释放行为差异也较大，前者在10 d以后释放明显放缓，40 d累积释放量不足75%；而后者在整个释放周期内匀速释放，40 d累积释放超过90%（图5）。将两者的释放曲线按 Korsmeyer-Peppas方程 拟合，分别 为 Q= 43.458t0.156（R2=0.994 0）和 Q=21.187t0.450（R2= 0.987 6），根据n值推断，前者药物主要以Fick′s扩散为主（n=0.156），而后者释放是扩散和溶蚀综合作用的结果（n=0.450）。释药机制差异的原因可能是PEG-PLGA微球中亲水性链段PEG很快降解溶蚀，增加微球内部新的孔洞，使释放介质更易进入微球内部，进一步加剧PLGA链段的降解。并且由于引入PEG链段，载药微球的相转变温度（Tg）由45.1℃降至22.1℃，在37℃释放介质的孵育下，PEGPLGA的聚合物链逐渐发生从玻璃态向高弹态的转化，大分子的运动增加，体积膨胀，加速溶蚀降解。

表4　不同载体材料制备的微球的性质比较Table 4 Different characteristics of microspheres prepared by various carrier materials（±s，n=3）

表4　不同载体材料制备的微球的性质比较Table 4 Different characteristics of microspheres prepared by various carrier materials（±s，n=3）

载体材料　　载药量/%包封率/%突释率/%粒径/ μm PEG-PLGA　10.15±0.16　91.36　15.15±0.49 40.37±0.15 PLGA 　7.13±1.10　64.16　43.60±0.61 56.49±0.24

图5 不同载体材料制备的微球的释放曲线

Figure 5 The effect of microsphere carrier materials on the drug release（n=3）

3.3.2 蛋白在微球内部的分布情况 利用CLSM可观察到样品中的荧光物质［12］，本文以荧光蛋白FITC-BSA（激发波长：495 nm，绿色荧光）代替BSA作为模型药物制备微球，通过CLSM观察荧光蛋白在微球中的分布（图6）。图中绿色荧光物质为FITC-BSA，亮度越高的地方表示蛋白量越多。可见，PLGA微球里蛋白较多地分布在微球的表面且聚集在内部孔洞中，而PEG-PLGA微球里蛋白均匀分散，较少吸附在孔壁上，整体荧光强度明显高于PLGA微球，这与载药量和包封率测得结果吻合。原因可能是PEG-PLGA的PEG亲水链段能提高载体与亲水性蛋白药物的相容性和分散性，减少固化过程中药物随着水分子扩散而大量吸附于孔洞内壁的情况。

a.PLGA微球；b.PEG-PLGA微球。图6 不同载体材料制备的微球的CLSM图Figure 6 CLSM pictures of FITC-BSA microsphere slices prepared by different carrier materials

3.3.3 DSC表征情况 PEG-PLGA微球和PLGA微球的DSC曲线见图7。可见，BSA在102.9、123.5℃有2个吸热峰，而PLGA载药微球和PEG-PLGA载药微球分别只有48.0℃和37.2℃的单峰，BSA的2个吸热峰都消失了，说明2种材料的微球BSA都被包裹在微球内部，致使其相转变峰消失。再对比PLGA载药微球和PEG-PLGA载药微球，前者在包载BSA前后Tg由28.7℃升至45.1℃、转变热焓由2.888 J/g升至6.717 J/g，主要是因为PLGA易与蛋白分子的羟基键形成氢键，导致链段运动困难，使载药微球的Tg升高、转变热焓增加。而PEG-PLGA微球在包载BSA前后，Tg反而由29.4℃降至22.1℃，吸热峰由47.8℃降至37.2℃，原因可能是PEG的引入增大了链端羰基的空间位阻，使得BSA的羟键不能与PLGA形成氢键，而以无定型态分散于PEGPLGA微球中，反而减小后者分子链缠结，增大链段的活动空间，使得Tg不升反降。

a.BSA；b.PLGA空白微球；c.PLGA空白微球和BSA的物理混合物；d.PLGA载药微球；e.PEG-PLGA空白微球；f.PEG-PLGA空白微球和BSA的物理混合物；g.PEG-PLGA载药微球。图7 不同载体材料制备的空白/载药微球的DSC表征曲线Figure 7 DSC thermogram of microspheres prepared by different carrier materials

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（责任编辑：陈翔）

中图分类号：R944.4

文献标志码：A

文章编号：1006-8783（2016）03-0269-06

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016011202

收稿日期：2016-01-12

基金项目：广东省医院药学研究基金项目（2015SW12）

作者简介：钟晨（1989—），女，2013级硕士研究生，Email：loyalty2012@126.com；通信作者：张永明（1965—），男，博士，主任药师，从事缓控释制剂研究，电话：020-85253112，Email：874477522@qq.com。

Study on the drug release characteristics of PEG-PLGA microspheres and PLGA microspheres prepared by SPG membrane emulsification

ZHONG Chen1，LUO Yuyan2，GUO Zhefei2，LUO Yongmei1，ZHANG Yongming2
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510006，China；2.Department of Pharmacy，The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China）

AbstractObjective To study a new prescription process of PEG-PLGA microspheres for protein drugs by SPG membrane emulsification and compare the drug release characteristics of PEG-PLGA microspheres and PLGA microspheres.Methods SPG membrane emulsification was chosen to prepare sustain-released microspheres with bovine serum albumin BSA as model drug and PLGA as carrier material.The material varieties and the amount of Span 80 were optimized to evaluate the drug loading encapsulation efficiency in vitro release particle size.CLSM and DSC were used to study the mechanism of PLGA and PEG-PLGA drug-load and release differences.Results The optimized PEG-PLGA microspheres were round and uniform in shape and size.The average size was 42.89 μm with PDI of 0.21 the entrapment efficiency was 91.40% and the burst release rate was 16.23%.The 40 d cumulative release amount was over 90%.Conclusion PEG-PLGA sustain-released microspheres can effectively increase drug loading and entrapment efficiency lower the burst release rate and release uniformly and completely.

Key wordsPEG-PLGA PLGA SPG membrane emulsification sustain-released microspheres