深海放线菌Streptomyces sp.WP6次生代谢产物的研究

周婷婷，谢春兰，张改云，杨全



深海放线菌Streptomyces sp.WP6次生代谢产物的研究

周婷婷1，2，谢春兰1，2，张改云2，杨全1

（1.广东药科大学中药学院，广东广州510006；2.国家海洋局第三海洋研究所海洋生物资源遗传重点实验室，福建厦门361005）

摘要：目的研究深海来源链霉菌Streptomyces sp.WP6具有生物活性的次级代谢产物。方法采用正相硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、TLC薄层制备层析色谱、中压快速制备层析色谱和高压液相色谱等方法分离纯化次生代谢产物，采用13C NMR、1H NMR、HMBC、HSQC、1H-1H COSY、LC-MS等波谱技术鉴定结构。结果从该菌株发酵产物中分离得到8个次级代谢产物，分别鉴定为：邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（1）、N-乙酰基酪胺（2）、脯氨酸-亮氨酸（3）、N-乙酰色胺（4）、吲哚-3-甲酸（5）、苯乙酸（6）、环（脯氨酸-苯丙氨酸）（7）、（4S）-4，10二羟基-10甲基-2烯-1，4内酯（8）。结论首次从Streptomyces sp.WP6发酵产物中分离到上述8个次生代谢产物。

关键词：放线菌；链霉菌；生物活性；次级代谢产物

网络出版时间：2016-05-23 16：28 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160523.1628.004.html

放线菌是最重要和最大的药源微生物种群，现已发现的天然抗生素中约有70%来源于放线菌家族，其中链霉菌属占90%以上［1］。但是，多年来主要集中于陆地放线菌的研究开发，次级代谢产物的高度重复率已成为新型药物研发的瓶颈［2］。由于海洋来源的放线菌次级代谢产物结构丰富多样且研究相对较少，因此对海洋放线菌特别是深海来源的放线菌次级代谢产物进行研究，有望为海洋来源的新型药物研发提供模式结构及丰富我国海洋微生物天然产物库。

深海来源放线菌Streptomyces sp.WP6是由国家海洋局第三海洋研究所张改云从西南印度洋-2 539 m沉积物中分离到的链霉菌属菌株，关于该菌的化学成分研究目前未见文献报道。本文对该菌株进行扩大规模发酵并对其发酵产物进行系统的化学成分研究，其中提取分离出8个代谢产物，经鉴定为邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（1）、N-乙酰基酪胺（2）、脯氨酸-亮氨酸（3）、N-乙酰色胺（4）、吲哚-3-甲酸（5）、苯乙酸（6）、环（脯氨酸-苯丙氨酸）（7）、（4S）-4，10二羟基-10甲基-2烯-1，4内酯（8），所有化合物均为首次从Streptomyces sp.WP6发酵产物中分离得到。

1 仪器与材料

1.1 仪器与材料

Bruker AV400核磁共振波谱仪（美国bruker公司）；Xevo G2 Q-Tof三重四极杆飞行时间质谱仪（美国Waters公司）；Eyela旋转蒸发仪（日本东京理化公司）；IS-RDS3C恒温振荡器（美国精骐有限公司）；分析型、制备型薄层色谱硅胶板和柱色谱硅胶（烟台江友硅胶有限公司）；Sephadex LH-20凝胶（40～70 μm，Amersham Pharmacia公司）。

1.2 菌株来源

从西南印度洋-2 539 m的沉积物中分离到实验菌株，通过16s rRNA基因序列（1 489 bp）比对，结合其培养特征分析，与Streptomyces rutgersensis NBRC 18819T相似度为99.18%，由国家海洋局第三海洋研究所张改云鉴定为Streptomyces rutgersensis。

1.3 发酵培养基

大豆蛋白胨5 g/L，淀粉15 g/L，甘油15 g/L，细菌学蛋白胨15 g/L，海盐30 g/L，pH 7.4。

2 菌株发酵与次生代谢产物分离

2.1 发酵

将适量生长良好的深海来源链霉菌Streptomyces rutgersensis接种到装有400 mL液体培养基的1 L的锥形培养瓶中，28℃、180 r/min培养2 d，将一级种子培养液以3%（体积比）的接种量接种到5 L（含1.5 L培养基）的锥形培养瓶中，28℃、180 r/min培养2 d，将二级种子培养液以5%（体积比）的接种量接种到50 L（含40 L培养基）的发酵罐中，28℃、180 r/min发酵培养7 d。

2.2 次级代谢产物分离

发酵产物经16 000 r/min离心得到发酵液和菌丝体，发酵液经乙酸乙酯萃取3次后减压浓缩得粗提物A；菌丝体首先用甲醇浸泡3次后减压浓缩，然后再经乙酸乙酯萃取得到粗提物B。两部分粗提物经TLC检测后成分相近，故合并得总浸膏17 g。浸膏经过ODS反相硅胶柱用甲醇-水梯度洗脱（5%→100%），得到10个流分（Fr.1～Fr.10）。Fr.2依次经过Sephadex LH-20（三氯甲烷-甲醇，体积比为1∶1）、正相硅胶柱层析反复分离得到化合物1（9.8 mg）和化合物2（51.0 mg），Fr.3用上述同样的方法分离得到化合物3（29.2 mg），Fr.5依次经过Sephadex LH-20（甲醇）、TLC薄层制备层析色谱纯化得到化合物4（13.2 mg），Fr.6依次经过Sephadex LH-20（三氯甲烷-甲醇，体积比为1∶1）、正相硅胶柱层析纯化得到化合物5（3.3 mg）、化合物6（50.4 mg）、化合物7 （10.0 mg），Fr.8依次经过Sephadex LH-20（三氯甲烷-甲醇，体积比为1∶1）、正相硅胶柱层析反复分离得到化合物8（4.0 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：淡黄色油状（丙酮），mp 55℃。HRESIMS m/z：413.266 7［M+Na］+（calcd for C24H38O4Na，413.266 8）。1H NMR（CD3COCD3，400 MHz）δ：7.67（2H，dd，J=3.3，5.7 Hz，H-12，24），7.77（2H，dd，J=3.3，5.7 Hz，H-11，23），4.22（4H，t，J=5.2 Hz，H-8，20），4.22（2H，t，J=5.2 Hz，H-5，17），1.40（4H，m，H-4，16），1.36（4H，m，H-3，15），1.45（4H，m，H-6，18），1.35（4H，m，H-2，14），0.95（6H，t，J=7.4 Hz，H-1，13），0.91（6H，t，J=7.2 Hz，H-7，19）。13C NMR （CD3COCD3，100 MHz）δ：167.1（s，C-9，21），132.6 （s，C-10，22），131.1（d，C-12，24），128.7（d，C-11，23），67.5（t，C-8，20），38.8（d，C-5，17），30.2（t，C-4，16），28.8（t，C-3，15），23.6（t，C-6，18），22.7（t，C-2，14），13.4（q，C-1，13），10.4（q，C-7，19）。以上数据与文献［3］报道一致，故鉴定化合物1为邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯［di-（2-ethylhexyl）phthalate］。

化合物2：白色粉末（甲醇），mp 169℃。HRESIMS m/z：202.083 8［M+Na］+（calcd for C10H13NO2Na，202.084 4）。1H NMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.02（1H，d，J=8.5 Hz，H-4，8），6.72（1H，d，J= 8.5 Hz，H-5，7），3.33（2H，t，J=7.3 Hz，H-1），2.68 （2H，t，J=7.3 Hz，H-2），1.90（3H，s，H-2）。13C NMR （CD3OD，100 MHz）δ：171.8（s，C-1′），155.5（s，C-6），129.8（s，C-3），129.3（d，C-4，8），114.9（d，C-5，7），41.0（t，C-1），34.5（t，C-2）21.2（q，C-2′）。以上数据与文献［4-5］报道一致，故鉴定化合物2为N-乙酰基酪胺（N-acetyltyramine）。

化合物3：白色粉末（三氯甲烷），mp 163～165℃。HRESIMS m/z：233.128 6［M+Na］+（calcd for C11H18N2O2Na，233.126 6）。1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ：4.11（1H，t，J=8.0 Hz，H-6），4.01（1H，dd，J=3.7，9.6 Hz，H-9），3.56（2H，m，H-3），1.53 （1H，m，H-10a），2.03（1H，m，H-10b），2.11（1H，m，H-5a），2.34（1H，m，H-5b），1.78（1H，m，H-11），0.99 （3H，d，J=6.6 Hz，H-13），1.90（1H，m，H-4a），2.01 （1H，m，H-4b），0.94（3H，d，J=6.6 Hz，H-12），6.46 （1H，s，NH）。13C NMR（CDCl3，100 MHz）δ：170.5 （s，C-7），166.3（s，C-1），59.0（d，C-6），53.4（d，C-9），45.5（t，C-3），38.5（t，C-10），28.1（t，C-5），24.6 （d，C-11），23.3（q，C-13），22.7（t，C-4），21.2（q，C-12）。以上数据与文献［6-7］报道一致，故确定化合物3为脯氨酸-亮氨酸［cyclo-（Pro-Leu）］。

化合物4：乳白色油状（甲醇），bp（484.7± 28.0）℃。HRESIMS m/z：225.101 0［M+Na］+（calcd for C12H14N2ONa，225.100 4）。1H NMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.08（1H，s，H-6），7.08（1H，td，J=1.0，7.8 Hz，H-2），7.00（1H，td，J=0.9，7.8 Hz，H-5），7.55 （1H，d，J=7.8 Hz，H-4），7.34（1H，d，J=7.8 Hz，H-7），3.47（2H，t，J=7.4 Hz，H-11），2.94（t，J=7.4 Hz，H-10），1.93（s，H-2′）。13C NMR（CD3OD，100 MHz）δ：173.3（s，C-1′），138.1（s，C-8），128.8（s，C-9），123.4（d，C-6），122.3（d，C-2），119.5（d，C-5），19.2 （d，C-4），113.2（s，C-3），112.2（d，C-7），41.5（t，C-11），26.2（t，C-10），22.6（q，C-2′）。以上数据与文献［8］报道一致，故鉴定化合物4为N-乙酰色胺（N-acetyltryptamine）。

化合物5：淡黄色粉末（丙酮），mp 226～228℃。HRESIMS m/z：184.039 2［M+Na］+（calcd for C9H7NO2Na，184.037 4）。1H NMR（CD3COCD3，400 MHz）δ：8.06（1H，d，J=2.5 Hz，H-2），7.22（1H，td，J=7.3，2.1 Hz，H-5），7.20（1H，td，J=7.3，2.1 Hz，H-6），8.16（1H，dd，J=7.3，2.5 Hz，H-4），7.52（1H，m，H-7），11.02（1H，brs，NH）。13C NMR （CD3COCD3，100 MHz）δ：165.4（s，C-1），136.8（s，C-7a），131.9（s，C-3a），126.5（d，C-2），122.4（d，C-5），121.2（d，C-6），121.0（d，C-4），112.0（d，C-7），107.7（s，C-3）。以上数据与文献［9］报道一致，故鉴定化合物5为吲哚-3-甲酸（indol-3-carboxylic acid）。

化合物6：白色粉末（甲醇），mp 76.5℃。HRESIMS m/z：159.043 0［M+Na］+（calcd for C8H8O2Na，159.042 2）。1H NMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.23-7.32（5H，m，H-4，5，6，7，8），3.59（2H，s，H-2）。13C NMR（CD3OD，100 MHz）δ：174.3（s，C-1），134.6（s，C-3），129.0（d，C-4，8），128.1（d，C-5，7），126.6（d，C-6），40.6（t，C-2）。以上数据与文献［4］报道一致，故确定化合物6为苯乙酸（phenylaceticacid）。

化合物7：黄色粉末（丙酮），mp 146～148℃。HRESIMS m/z：267.110 8［M+Na］+（calcd for C14H16N2O2Na，267.110 9）。1H NMR（CD3COCD3，400 MHz）δ：7.35（2H，t，J=7.4 Hz，H-4′，6′），7.31（2H，t，J=7.4 Hz，H-3′，7′），7.24（1H，t，J=7.4 Hz，H-5′），4.13（1H，t，J=8.4 Hz，H-6），4.40（1H，t，J=5.8 Hz，H-3），3.39（1H，m，H-1″a），3.53（1H，m，H-1″b），3.03 （1H，dd，J=7.0，14.4 Hz，H-1′a），3.34（1H，dd，J=4.7，14.4 Hz，H-1′b），1.67（1H，m，H-3″a），2.14（1H，m，H-3″b），1.86（2H，m，H-2″）。13C NMR （CD3COCD3，100 MHz）δ：169.1（s，C-1），165.0（s，C-4），137.3（s，C-3′），129.7（d，C-4′），129.7（d，C-6′），128.3（d，C-3′），128.3（d，C-7′），126.6（d，C-5′），58.7（d，C-6），56.2（d，-3），44.7（t，C-1″），36.1（t，C-1′），28.0（t，C-3″），22.1（t，C-2″）。以上数据与文献［6］报道一致，故鉴定化合物7为环（脯氨酸-苯丙氨酸）［cyclo-（Pro-Phe）］。

化合物8：乳白色油状（甲醇），bp（360.8±15.0）℃，［α］2D5+8（c 0.20，MeOH）；HRESIMS m/z：235.130 1 ［M+Na］+（calcd for C12H20O3Na，235.131 0）。1H NMR （CD3OD，400 MHz）δ：7.73（1H，dd，J=5.7，1.4 Hz，H-3），6.11（1H，dd，J=5.7，2.0 Hz，H-2），5.16（1H，m，H-4），1.82（1H，m，H-5a），1.65（1H，m，H-5b），1.18（6H，s，H-11，12），1.48（2H，m，H-6）。13C NMR （CD3OD，100 MHz）δ：176.2（s，C-1），160.0（d，C-3），121.9（d，C-2），85.9（d，C-4），71.7（s，C-10），44.9 （t，C-9），34.3（t，C-5），31.3（t，C-7），29.4（q，C-11，12），26.3（t，C-8），25.5（t，C-6）。以上数据与文献［10-11］报道一致，故鉴定化合物8为（4S）-4，10二羟基-10甲基-2烯-1，4内酯［（4S）-4，10-dihydroxy-10-methylundec-2-en-1，4-olide］。

以上8个化合物的结构式见图1。

图1　深海放线菌Streptomyces sp.WP6中分离到的8个次级代谢产物Figure 1 Secondary metabolites isolated from deep-sea-derived actinomycete Streptomyces sp.wp6

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（责任编辑：陈翔）

中图分类号：R284.2

文献标志码：A

文章编号：1006-8783（2016）03-0282-04

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016020101

收稿日期：2016-02-01

基金项目：国家海洋局第三海洋研究所基本科研业务费专项资金资助项目（2015028）；海洋经济创新发展区域示范专项经费资助项目（GD2012-D01-001）

作者简介：周婷婷（1991—），女，2014级硕士研究生，Email：1225247873@qq.com；通信作者：杨全（1972—），男，博士，教授，主要从事中药资源方面研究，Email：yangquan7208@vip.163.com

Study on the secondary metabolites from a deep-sea-derived actinomycete Streptomyces sp.WP6

ZHOU Tingting1，2，XIE Chunlan1，2，ZHANG Gaiyun2，YANG Quan1
（1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.Key Laboratory of Marine Biogenetic Resources，Third Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Xiamen 361005，China）

AbstractObjective To study the biological activity secondary metabolites from Streptomyces sp.WP6.

Methods Normal phase silica gel column chromatography RP gel column chromatography Sephadex LH-20 gel column chromatography preparative thin-layer chromatography rapid preparative HPLC and medium pressure HPLC were used for isolating and purifying the secondary metabolites.The structures of secondary metabolites were identified by13C NMR1H NMR HMBC HSQC1H-1H COSY and LC-MS.Results Eight secondary metabolites were obtained and identified as di- 2-ethylhexyl phthalate 1 N-acetyltyramine 2 cyclo- Pro-Leu 3 N-acetyltryptamine 4 indol-3-carboxylic acid 5 phenylaceticacid 6 cyclo- Pro-Phe 7 4S -4 10-dihydroxy-10-methylundec-2-en-1 4-olide 8 .Conclusion All compounds were isolated for the first time from Streptomyces sp.WP6 for the forst time.

Key wordsactinomycete Streptomyces sp. biological activity secondary metabolites