湖北武汉茶树内生真菌多样性及种群结构

王雪萍++龚自明++谭荣荣++曹丹++高士伟++郑鹏程++叶飞++王胜鹏+++滕靖++郑琳++刘盼盼

摘要：为了解武汉地区茶树内生真菌的多样性，从鄂茶1号、鄂茶5号、福鼎大白茶的茎、叶共210个组织块中，分离获得166株内生真菌菌株。结果表明，茶树受内生真菌侵染程度较高，74.29%的组织有内生真菌存在。根据rDNA-ITS系统发育分析，从中分离鉴定内生真菌15属，27个分类单元，主要有链格孢（Alternaria）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria）、刺盘孢（Colletotrichum）、间座壳属（Diaporthe）、镰孢霉（Fusarium）、赤霉（Gibberella）、小从壳菌（Glomerella）、球座菌（Guignardia）、新壳梭孢菌（Neofusicoccum）、拟盘多毛孢（Pestalotiopsis）、拟茎点霉（Phomopsis）、格孢腔菌（Pleosporales）、拟青霉（Paecilomyces）、腐霉（Pythium）、丝核菌（Rhizoctonia）和2种未知真菌。根据相对频率，葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、盘长孢状刺盘孢（Colletotrichum gloeosporioides）、芒果球座菌（Guignardia mangiferae）等在茶树中比较常见。不同组织部位、不同品种内生真菌分布及组成存在差异，表现出较丰富的多样性。

关键词：茶树；内生真菌；多样性；种群结构；武汉

中图分类号：S571.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）21-5563-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.031

Diversity and Population Structure of Endophytic Fungi from

Camellia sinensis in Wuhan， Hubei

WANG Xue-ping，GONG Zi-ming，TAN Rong-rong，CAO Dan，GAO Shi-wei，ZHENG Peng-cheng，

YE Fei，WANG Sheng-peng，TENG Jing，ZHENG Lin，LIU Pan-pan

（Institute of Fruit & Tea，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Tea Engineering and Technology Research Center，Wuhan 430064，China）

Abstract： Aimming to study the diversity of endophytic fungi isolated from Camellia sinensis in Wuhan，166 strains of endophytic fungi were isolated from 210 tissues，including tea stems and leaves from E-Cha No.1，E-Cha No.5 and Fuding Dabaicha. The results showed that，endophytic fungi were in 74.29 percent of plant tissues. 27 taxa in 15 genera were identified by rDNA-ITS sequence analysis，which where Alternaria，Botryosphaeria，Colletotrichum，Diaporthe，Fusarium，Gibberella，Glomerella，Guignardia，Neofusicoccum，Pestalotiopsis，Phomopsis，Pleosporales，Paecilomyces，Pythium，Rhizoctonia and two unkown endophytic fungi. In accordance with relative frequency，Colletotrichum gloeosporioides，Botryosphaeria dothidea and Guignardia mangiferae were more common in tea. The isolation results showed that there were some notable differences between distribution and composition of the endophytic fungi isolated from different cultivars and different tissues of tea，it also showed rich diversity.

Key words： tea tree； endophytic fungi； diversity； populatioon structure； Wuhan city

植物内生真菌（endophytic fungi）是指其生活史中一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织内部，不引发植物产生明显病症的一类真菌[1，2]。内生于健康植物组织中的真菌具有极其丰富的物种多样性[3]。这类特殊的真菌资源不仅可以产生重要的生物活性物质[4]，而且可以促进宿主生长[5]，增强抗虫能力[6]，在农业生物防治、医药卫生等方面具有重要的应用价值[7]。

茶树（Camellia sinensis O.ktzea）是一种多年生常绿灌木或乔木，是山区农民的主要收入来源，中国是茶树发源地，茶樹栽培已有3 000多年的历史，茶树已和茶树内生真菌形成一种长期协同进化的关系。卢东升等[8]从豫南茶园5 760组织块中分离纯化内生真菌579株，经鉴定为7科15属18种，游见明[9，10]从四川省自贡市荣县五通农场茶园的茶树根、茎、叶中分离得到内生真菌14属，胡雲飞等[11]在南京市紫金山中山陵十年生“龙井长叶”未耕垦茶园的健康根系中分离得到内生真菌7属12种，周游等[12]从白叶单丛成熟叶片、嫩叶和嫩茎中分离到内生真菌6属。本试验从湖北茶树中分离内生真菌，并根据菌落形态和孢子等形态特征，结合真菌的ITS序列进行菌株鉴定，对茶树内生真菌的类群进行研究，以为进一步挖掘利用茶树内生真菌资源，阐明茶树内生真菌的生态功能提供基础性资料。

1 材料与方法

1.1 材料

福鼎大白茶、鄂茶1号、鄂茶5号3个供试茶树品种枝梢采集自湖北省农业科学院果树茶叶研究所试验茶园。

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL，培养液pH 7.0。液体培养基不加琼脂。真菌DNA提取试剂盒为上海生物工程有限公司产品，DL2 000 DNA Marker为Takara公司产品；引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′、ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，由上海生物工程有限公司合成；试验使用的生化及分子生物学试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 取样方法 按照5点采样法在3个茶树品种园选取5个点，每个点选择2株茶树，每株采集枝梢3枝（当年生枝条），每个枝条3个茎样和3片叶片。

1.2.2 茶树内生真菌的分离、纯化、DNA提取 样本采回实验室后24 h内进行内生真菌的分离，参照谢丽华等[13]的方法进行表面消毒及消毒验证。参照李慧玲等[14]的方法进行内生真菌的分离和纯化，观察记录菌落形态并编号。按照真菌DNA提取试剂盒的方法提取真菌DNA。

1.2.3 目的片段扩增和测序 采用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增所提取真菌DNA的ITS保守区。PCR反应体系：2 ng基因组DNA，12.5 μL dNTPs mixture（2.5 mmol/L），10 pmol/L ITS1，10 pmol/L ITS4，用dd H2O补充至总体积25 μL。反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。扩增产物经1.0%琼脂糖电泳凝胶成像监测后无引物二聚体，送上海生物工程有限公司测序。

1.2.4 序列分析和系统发育树构建 ITS序列在GenBank数据库中通过BLAST搜索找出相近的序列信息，通过ClustalX1.81进行序列的匹配排序，然后用Neighbor-Joining分析方法进行分子系统学分析。

1.2.5 数据处理 采用分离率（isolation rate，IR）、分离频率（Relative frequency，RF）、Shannon-Wiener多样性指数、Margalef丰富度指数、Pielou均匀度指数分析茶树内生真菌的分布、多样性及偏好性[15]。

分离率指从样本组织块中分离得到的菌株数与样本组织块数的比值，用于衡量植物组织中内生真菌的丰富程度和每个组织块受多重侵染的频率。

分离频率是指分离到的某一指定类型内生真菌的菌株数量占分离的内生真菌菌株数量的百分率，用于比较和判断优势菌群。

采用Shannon-Wiener多样性指数（H′）和Margalef丰富度指数（R）分析内生真菌的多样性，H′= -∑PilnP，R=（S-1）/Log2（N），其中Pi为第i种的个体数占总个体数N的比例，S为物种数。

采用Pielou指数（Pielou evenness index，J）分析菌群分布的均匀程度，J=H′/ln（S）。

2 结果与分析

2.1 内生真菌的定植及分离

茶树植物组织受到内生真菌侵染的程度较高，74.29%的组织块有内生真菌存在。从组织性质来看，叶中内生真菌的定植率明显低于枝条；不同品种内生真菌定植率也存在差异，从高到低为鄂茶5号、鄂茶1号、福鼎大白茶（表1）。

从3个不同茶树品种的枝条、叶片共210个组织块中各分离得到94、72株内生真菌，其中鄂茶1号、鄂茶5号枝条的内生真菌分离菌株数最多，分别为34株和31株，分离率分别为97.14%、88.57%，福鼎叶片的内生真菌分离率最低，为57.14%。

2.2 茶树内生真菌DNA提取及28S rRNA序列特异性扩增

提取分离纯化得到的茶树内生真菌DNA，应用真菌28S rRNA序列通用引物进行特异性扩增，得到约600 bp的目标片段，见图1。

2.3 内生真菌的分子生物学鉴定

茶树166株内生真菌鉴定为15个属、27个分类单元，包括丝孢菌3种、腔孢菌9种、子囊菌11种、腐霉2种和未知真菌2种（表2）。福鼎枝条、叶片分别分离3种、4种，鄂茶1号枝条和叶片分别分离14种、5种，鄂茶5号枝条和叶片分别分离8种、3种。

2.4 茶树内生真菌的组成与分布

依据庞雄飞等[16]的研究，某物种占整体物种的百分比≥10%为优势属（种），1%～10%为常见属（种），百分比≤1%为稀有属（种）。从表3可以看出，茶树内生真菌优势种群为Colletotrichum gloeosporioides、Botryosphaeria dothidea和Guignardia mangiferae，分别占真菌总数的25.30%、18.67%和10.24%，稀有种群11个，占真菌总数的6.66%。

Botryosphaeria dothidea、Colletotrichum gloeosporioides、Diaporthe actinidiae、Glomerella cingulata在枝條和叶片中均可以分离到，而Gibberella intermedia、Pestalotiopsis theae、Pythium vexans只存在于枝条组织，Guignardia mangiferae、Paecilomyces lilacinus只存在于叶片组织。内生真菌数量、真菌种类枝条大于叶片，而主要优势菌的分布比例以叶片较高。茶树内生真菌在不同组织部位的分布存在差异，表现出一定的组织专一性。

福鼎大白茶、鄂茶1号、鄂茶5号3个茶树品种分离到的内生真菌分类单元分别为17、10、7个，菌株数分别为49、60、57株。优势种群中Botryosphaeria dothidea、Colletotrichum gloeosporioides在3个供试茶树品种中均有分布，而Guignardia mangiferae只分布于福鼎和鄂茶5号叶片中。

2.5 茶树内生真菌的多样性

从表4可以看出，茶树内生真菌具有丰富的物种多样性，总体多样性指数达到3.23，而且表现出鄂茶5号叶片<福鼎大白茶枝条<福鼎大白茶叶片<鄂茶1号叶片<鄂茶5号枝条<鄂茶1号枝条。不同品种、部位内生真菌的均匀度指数差异不大。

3 小结与讨论

本研究对同一栽培管理下种植的福鼎大白茶、鄂茶1号、鄂茶5号3个茶树品种进行了内生真菌分离鉴定和多样性差异比较，共分离获得内生真菌166株，其中164株经鉴定属于15个属，在一定程度上反映了武汉茶树内生真菌的多样性。枝条和叶片中内生真菌的分布并不均一，差异比较明显，说明茶树内生真菌具有一定的组织专一性。与徐焰平等[17]、汪立群等[18]的研究结果一致表明，品种也影响茶树内生真菌种类和数量分布。

陈晖奇[19]、武汉琴[20]研究认为刺盘孢、芒果球座菌为茶树的优势菌群，本研究中葡萄座腔菌的分离频率为18.67%，与盘长孢状刺盘孢、芒果球座菌同为茶树优势菌群，这可能与所处地域、外界环境及茶树本身微环境有关，即不同的外部及内部环境造就了不同内生真菌类群的入侵和定殖。在鉴定过的内生真菌中有3个属仅各分离到1株，它们可能在组织内分布频率较低、或培养基和培养条件不大适合而降低了分离率，也可能本身为机会菌。

从所分离到的内生真菌种群来看，本研究所获得的茶树内生真菌多数是腐生性或土壤中普遍存在的真菌类群。但所采集的样本全部来自健康茶树组织，在茶树材料表面消毒彻底的前提下，认为这些真菌在茶树组织内符合Petrini[1]及Stone等[2]对于植物内生真菌的有关定义，可以认为这些真菌是内生的或至少是不引起病害的寄生性真菌。

内生真菌在植物中的分布受生境、季节、年龄等因素的影响[21]，其多样性的研究往往受到内生真菌分离方法的制约。因此，在随后的茶树内生真菌研究中，应综合考虑这些因素，获得大量的内生真菌资源，为进一步寻找茶树促生真菌以及筛选内生真菌来源的生物活性物质奠定基础。

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