4株石杉碱甲生产菌原生质体制备与再生条件的研究

张方方　刘海元　张晓琼等

摘要：为高效获得内生真菌U29、U32、U50、U51石杉碱甲生产菌株的原生质体和为原生质体融合及基因组改组选育高产石杉碱甲菌株提供参考，研究了溶解酶的浓度、加酶量、酶解温度、稳定剂等因子对4株菌原生质体制备的影响。通过研究获得了菌株原生质体制备的优化条件：溶壁酶浓度为3.0%、加酶量为2.0 mL/100 mg、菌龄为5 d、酶解时间为2.5 h、酶解温度为30 ℃、0.6 mol/mL氯化钠为稳定剂、CYM培养基为再生培养基。在此优化条件下，4株菌的原生质体的产量均大于7.0×107 个/mL，再生率可达20%以上。

关键词：内生真菌；溶解酶；原生质体制备；原生质体再生

中图分类号： S336文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0085-05

收稿日期：2015-05-14

基金项目：福建省社会发展引导性项目（编号：2015Y01010244）；福建省财政厅专项经费[编号：闽财指（2011）1238]；福建省大学生创新创业项目（编号：201310393057）。

作者简介：张方方（1990—），女，硕士研究生，主要从事中药生物工程研究。E-mail：1170563131@qq.com。

通信作者：吴水生，从事中药生物工程研究。E-mial：wushuishengwss@163.com。石杉碱甲 （huperzine A，HupA） 是20世纪80年代，我国学者从药用植物蛇足石杉[Huperziaserrata （Thunb.） Trev.]中分离到的一种石松类倍半萜生物碱，具有高效、低毒、可逆性的乙酰胆碱酯酶抑制作用，目前已成为治疗阿尔茨海默病最有效的药物之一[1-3]。

内生真菌长期生活在植物体内能够产生与宿主植物相同或相似的化学成分[4]。自从1996年Strobel等[5]从短叶红豆杉中分离到1株产紫杉醇的内生真菌，利用内生真菌生产化合物被人们广泛接受[6]。笔者从闽泽马尾杉中分离到1株产石杉碱甲的内生真菌炭团菌NX9，但产量仅为1.12 μg/L，经紫外诱变得到4株产量较高的石杉碱甲生产菌U29、U32、U50、U51，产量分别为17.10、17.46、19.89、16.85 μg/L，但该产量仍较低无法实现工业化生产。通过菌种选育获得产量高、遗传稳定性好的菌种是实现利用内生真菌发酵生产石杉碱甲的首要前提。

原生质体育种能够快速、有效地提高菌株中代谢产物的产量，包括原生质体再生育种、原生质体诱变育种、原生质体融合育种等方法[7]。Jin等以10株产量较高的多杀菌素产生菌（Saccharopolyspora spinosa）为出发菌株，进行原生质体融合后获得的融合菌株S. spinosa 4～7，其多杀菌素产量比出发菌株提高了200.55%以上[8]。2002年出现的基因组改组技术则是在原生质体融合的基础上通过对正向突变株库进行多亲本的原生质体递推式融合而实现高效的定向育种，极大地加快了获得高产、稳产的菌株的速度[9]。制备大量有活性的原生质体是原生质体融合及基因组改组育种的前提[7]。有效的原生质体制备和再生方法是保证原主质体产量和活性的主要途径，原生质体的制备和再生主要受酶的种类与浓度、酶解时间与温度、菌龄、渗透压稳定剂、培养基成分等因素[10-11]的影响，且由于菌株间存在的差异性，导致原生质体制备和再生的方法存在差异[12]。优化原生质体制备及再生的最优条件是原生质体育种的重要方法。为此，本试验研究了溶解酶的浓度、加酶量、酶解温度、稳定剂、再生条件等对内生真菌U29、U32、U50、U51石杉碱甲生产菌株的原生质体制备效率的影响，旨在筛选出适合产石杉碱甲内生真菌的原生质体制备与再生的最优条件，为原生质体育种及基因组改组育种奠定基础，最终为微生物发酵法生产石杉碱甲且早日实现工业化生产奠定基础，从根本上解决石杉碱甲药源不足的问题。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种石杉碱甲产生菌U29、U32、U50、U51：由石杉碱甲产生菌NX9诱变所得，实验室保藏。

1.1.2培养基的配制（1） PDA液体培养基：马铃薯200 g/L；葡萄糖20 g/L。（2） PDA固体培养基：马铃薯200 g/L；葡萄糖20 g/L；琼脂15～20 g/L。（3）查氏培养基：蔗糖30 g/L；硝酸钠3 g/L；磷酸二氢钾1 g/L；氯化钾0.5 g/L；硫酸镁0.5 g/L；硫酸亚铁0.001 g/L；琼脂16 g/L。（4）CYM培养基：蛋白胨2 g/L；葡萄糖20 g/L；酵母膏2 g/L；硫酸镁5 g/L；磷酸二氢钾0.46 g/L；磷酸氢二钾1 g/L；琼脂16 g/L。（5） MYG培养基：麦芽糖5 g/L；酵母膏5 g/L；葡萄糖10 g/L。（6）酵母膏培养基：酵母膏5 g/L；蔗糖10 g/L。（7）再生固体培养基：以0.6 mol/L NaCl配制的PDA培养基、马丁培养基、查氏培养基、CYM培养基和酵母膏培养基。（8）再生半固体培养基：再生培养基中琼脂减半。所有培养基均以121 ℃，灭菌20 min。

1.1.3试剂溶壁酶（美国sigma公司）；氯化钠、蔗糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硝酸钠（国药集团化学试剂有限公司）；酵母膏 （广东江门生物技术开发中心有限公司）；蛋白胨 （广西环凯微生物科技有限公司）。

渗透压稳定剂：采用0.6 mol/L的NaCl溶液。HupA标准品（纯度>98%，长沙中仁生物技术有限公司，批号：2012120301）。

1.1.4仪器与设备MJP-250型霉菌培养箱（上海精宏实验设备有限公司），BSC-1360ⅡA2超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司），超高效液相质谱仪（Waters，Milford，MA，USA），ACQUITY UPLC BEH C18反相柱（Waters，100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。

1.2方法

1.2.1菌丝体培养将菌株U29、U32、U50、U51孢子液以10%（体积比）的接种量接种于含80 mL PDA液体培养基的250 mL三角摇瓶中，于28 ℃恒温箱中静置培养5 d，6层高级擦镜纸过滤，0.6 mol/L NaCl溶液淋洗3次，将菌丝体转移到直径为6 cm培养皿中，称质量待用。

1.2.2原生质体的制备、纯化与再生每100 mg菌丝体加 2 mL 酶解液，于适宜温度的恒温摇床中振荡酶解。每30 min吸取一定量的酶解液观察，计算原生质体数。酶解完毕后，酶解液用无菌棉花过滤，于3 700 r/min离心10 min，倒掉上清液，用渗透压稳定剂离心洗涤2次，收集原生质体重悬于渗透压稳定剂中，血球计数板计数。用渗透压稳定剂稀释原生质体，使之达到一定浓度，然后吸取0.3 mL加入含有4.7 mL再生半固体培养基的具塞试管中，摇匀后倒入再生固体培养基平板内，于28 ℃下培养7 d；同时，再吸取0.3 mL原生质体悬液加入已含有4.7 mL低渗半固体培养基的具塞试管中，摇匀后倒入PDA固体培养基平板，作为对照。观察菌落生长情况，用以下公式计算再生率：再生率=（再生固体培养基上菌落数-低渗固体培养基上菌落数）/原生质体数×100%。分别考察不同的溶解酶浓度、加酶量、菌龄、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂及浓度、再生培养基对原生质体制备与再生的影响。每个影响因素均平行考察3份，结果取平均值，获得石杉碱甲生产菌原生质体形成和再生的最佳条件。

2结果与分析

2.1酶浓度的选择

分别采用2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的溶壁酶酶解菌株U29、U32、U50、U51的菌丝体，在其他条件一致的情况下通过计算其原生质体的产量与再生率，考察原生质体制备与再生的最适酶浓度。发现溶壁酶浓度由2.0%至3.0%时石杉碱甲生产菌的原生质体产量及再生率均增大，虽然溶解酶浓度为35%时4株菌的原生质体产量均较大，但是原生质体的再生率却比3.0%时低，因此确定溶解酶的浓度为3.0%（表1）。

2.2加酶量的选择

分别将100 mg新鲜菌丝体加入1.0、2.0、3.0、3.5、4.0 mL 的酶液，溶解酶浓度为3.0%，研究加酶量对4株菌的原生质体产量及再生率的影响。加入的酶液过多或过少都难以得到最大量的原生质体，当加酶量为2.0 mL/100 mg时，4株菌的原生质体产量及再生率均达到最大（表2），因此确定最适宜的加酶量为2.0 mL/100 mg。

2.3菌龄的选择

将3.0%溶壁酶分别加入静止培养3、4、5、6、7 d的U29、U32、U50、U51菌丝体，加酶量2.0 mL/100 mg，考察菌龄对原表2加酶量对菌U29、U32、U50、U51原生质体产量及再生率的影响生质体产量和再生率的影响。发现随着菌龄的增加，4株菌的原生质体产量及再生率均增大，但培养时间过长原生质体产量及再生率均下降。当培养时间为5 d时，原生质体的产量及再生率均最大（表3），因此确定最佳菌龄为5 d。

2.4酶解时间的研究

在确定的最佳酶浓度、加酶量及菌龄条件下，分别研究了酶解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h后的原生质体产量及再生情况。发现酶解时间过短会导致细胞壁水解不充分，原生质体不能充分释放，产量较低，但原生质体活性较高，再生率较高；而酶解时间过长导致了原生质体皱缩，损害细胞质膜导致再生率急剧下降[13]。其中酶解2.5 h时4株菌的原生质体产量及再生率均达最大（表4）。因此，确定2.5 h为最佳酶解时间。

2.5酶解温度的选择

在上述最佳条件下，分别将U29、U32、U50、U51菌丝体置于26、28、30、32、34 ℃的恒温摇床中，在70 r/min条件下酶解2.5 h后对原生质体产量和再生率进行分析。发现当酶解温度为28～30 ℃时，原生质体产量与再生率随温度升高而增大，温度高于30 ℃后，4株菌的原生质体产量与再生率均明显下降（表5）。

2.6渗透压缓冲剂的选择

在上述最佳条件下，分别研究了氯化钾、氯化钠、蔗糖、甘露醇、硫酸镁、氯化钙等渗透压缓冲剂对菌U29、U32、U50、U51原生质体产量及再生率的影响。发现当酶浓度为30%、菌龄为5 d、酶解时间为2.5 h、酶解温度为30 ℃时，以氯化钠作为渗透压稳定剂制备4株菌的原生质体时，原生质体产量及再生率均最大，故选用氯化钠为最佳的渗透压稳定剂（表6）。此外，研究了不同浓度氯化钠对菌U29、U32、U50、U51原生质体产量与再生率的影响，发现氯化钠浓度在0.4～0.6 mol/L时，4株菌的原生质体产量及再生率随浓度的增大而增大，当浓度大于0.6 mol/L时，产量及再生率均下降（表7）。

2.7再生培养基的选择

采用上面研究所得最优条件制备4株菌的原生质体，然后分别将其接种到PDA、CYM、MYG、沙氏、酵母膏等再生培养基进行培养。发现不同培养基其再生率明显不同，以CYM再生培养基培养U29、U32、U50、U51原生质体时，再生率最高（图1）。因此，确定最佳的再生培养基为CYM培养基。

2.8原生质体的观察

4株菌菌丝体经溶壁酶在30 ℃作用下，恒温振荡处理约30 min后开始释放出原生质体，原生质体形状基本一致，多呈球形、透亮，同时可观察到大量菌丝片段（图2）。

3讨论

3.1酶浓度及加酶量对原生质体产量及再生率的影响

真菌细胞壁组分复杂，不同培养条件和不同菌龄细胞壁的结构和成分差异很大，而且酶解真菌细胞壁的过程还涉及到多个影响因素，本研究通过研究溶壁酶浓度、加酶量、菌龄、培养时间等因子对4株石杉碱甲生产菌原生质体制备的影响，获得了制备4株菌原生质体的最优条件。

真菌细胞壁的主要成分包括几丁质、糖原、蛋白质、半纤维素等。在形成原生质体的过程中，细胞壁被溶解酶酶解出孔洞，原生质体从这些孔洞中溢到周围的稳渗剂中。因此，细胞壁溶解酶在真菌制备原生质体的反应系统中起直接作用[14]。吴正钢等研究发现采用单一酶制备原生质体，消除细胞壁不完全只能形成少量的原生质体[15]，但本研究通过考察单一溶壁酶不同浓度对4株菌原生质体形成与再生的影响，研究发现溶壁酶的浓度应适当，过低或过高的酶浓度都不利于原生质体的形成与再生。低浓度的溶壁酶酶解作用不彻底，不利于原生质体的生成，过高浓度降低了原生质体的数量和活性，致使形成量与再生率都有明显下降。当酶浓度为30%时，原生质体的产量均大于6.0×107个/mL，再生率均大于16%，比采用复合酶系制备原生质体的产量及再生率高[14-15]，不仅简化了试验步骤而且节约成本。

加酶量对提高原生质体的产量及再生率的影响也较大，过大或过小都难以得到最大量的原生质体。加酶量过少酶解不彻底，菌丝中的原生质体无法得到充分的释放，且影响原生质体的活性，降低再生率。

3.2菌龄对原生质体制备及再生率的影响

真菌生理状态是决定原生质体产量及再生率的主要因素之一，不同的生长时期，真菌生理状态不同，细胞壁的结构、菌体活力及代谢水平也不相同。因此，菌龄是明显影响原生质体释放频率的主要因素。丝状真菌以年轻的菌丝用来分离原生质体最佳，尤其是生长对数期的菌体。本研究通过绘制4株菌的生长曲线，发现4株菌的对数生长期均为3～7 d，幼龄菌丝和老龄菌丝均不利于酶解。菌龄过长，细胞壁发生老化增厚，不易释放原生质体，菌龄过短则菌丝体易破裂[16]。研究还发现3～5 d的菌体随着培养时间的增加，原生质体产量及再生率均提高，当菌龄为5 d时，原生质体产量及再生率均达最大值，随后逐渐降低。

3.3酶解温度对原生质体制备及再生率的影响

不同的酶具有不同的最适温度，酶解温度直接影响酶的活性。只有在最适的酶解温度下，酶的活性才最高，酶促反应速率才最大。此外，酶解温度还影响真菌的生理状态、菌丝体细胞壁结构性疏散及原生质体的活力。通常，真菌的最适酶解温度为25～35 ℃，当温度在30 ℃时，4株菌原生质体的产量及再生率均达最大值，表明30 ℃为溶壁酶作用4株菌细胞壁的最适温度。

3.4不同渗透压稳定剂对原生质体制备及再生的影响

渗透压稳定剂既能维持原生质体内外渗透压的平衡，维持原生质体的形态，防止破裂或皱缩，影响原生质体活力，对酶的活性也有一定的促进作用，是影响原生质体制备与再生的重要因素。研究发现6种常用稳定剂中，以0.6 mol/L氯化钠为渗透压稳定剂时，4株菌的原生质体制备效果最好，可能由于氯化钠等有助于酶与底物结合，对酶反应起促进作用[17]。

3.5不同再生培养基对原生质体再生的影响

再生培养基的选择直接影响原生质体的再生率。本研究比较了PDA、CYM、MYG、酵母等5种再生培养基对4株菌原生质体再生率的影响，发现CYM再生培养基效果最好。可能由于酵母膏、蛋白质、氨基酸、糖类等营养物质可能是细胞壁合成的前体物质，或经过代谢转化成细胞壁的前体物质，或促进细胞代谢，参与细胞壁的加速合成。CYM培养基中同时含有酵母膏、蛋白质、氨基酸、糖类，丰富的营养物质更有利于细胞壁再生。

4结论

本试验研究了4株石杉碱甲生产菌原生质体制备及再生的条件，获得了原生质体制备及再生的最优体系：溶壁酶浓度为3.0%、加酶量为2.0 mL/100 mg、菌龄为5 d、酶解时间为2.5 h、酶解温度为30 ℃、0.6 mol/L氯化钠为稳定剂、CYM培养基为再生培养基。在此体系下，4株菌原生质体的产量均大于7.0×107个/mL，再生率均超过20%。本研究为原生质体融合及基因组改组选育高产石杉碱甲菌株奠定了重要基础。

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