响应面分析法优选桑寄生总黄酮的提取工艺

陈 睿，杨范莉，张 琳

(1.陕西省宝鸡市中医医院，宝鸡　721001；2.西安交通大学药学院，西安　710061；3.陕西中医药大学，咸阳　712046)



响应面分析法优选桑寄生总黄酮的提取工艺

陈 睿1，杨范莉2，张 琳3

(1.陕西省宝鸡市中医医院，宝鸡721001；2.西安交通大学药学院，西安710061；3.陕西中医药大学，咸阳712046)

摘要：目的 利用响应面法优化桑寄生总黄酮的提取工艺条件。方法 采用中心组合设计方法，分别研究乙醇体积分数、溶媒用量、提取时间及提取次数对总黄酮提取率的最佳提取工艺条件。结果 最佳提取工艺条件为：体积分数为40%的乙醇，液固比为40∶1，回流提取2次，每次1 h。结论在最佳工艺条件下，桑寄生总黄酮的提取率为1.15%，高于其他条件下的提取率，该工艺条件可为桑寄生总黄酮的工业生产提供依据。

关键词：桑寄生；总黄酮；提取工艺;响应面分析法

桑寄生(Taxillusherba)为桑寄生科植物桑寄生Taxilluschinensis(DC.)，常入药为干燥叶及茎枝，常寄生于桑、桃、李等多种植物上[1]，分布在我国的西南、中南、华南等地区[2]；具有补肾益肝、祛风除湿、通经安胎等功效，常用于治疗腰膝酸软、筋骨无力、风湿疼痛及胎动等[3-4]。文献报道，桑寄生中主要含有黄酮和甾体皂苷类化学成分[5-6]，有研究表明，桑寄生提取物有黄酮类化合物、甾体化合物、有机酸、胺类化合物、生物碱和氨基酸等[7-8]，其中黄酮类物质存在于多种植物药材中，为一类黄色素、次级代谢产物[9]，具有广泛的药用价值[10]。但目前对其主要化学成分总黄酮的提取工艺研究未见报道。响应面分析法可以找到最佳点，并灵敏考察各因素之间的交互作用[11]。本实验运用响应面分析法优化桑寄生总黄酮的提取工艺，以期高产、高效、节能地制备桑寄生总黄酮，为桑寄生总黄酮的工业化生产提供依据。

1仪器与试药

1.1仪器UV-1102紫外分光光度计(上海天美责任有限公司)；R200D电子分析天平(精度0.1 mg，德国Satorius公司)。

1.2试药桑寄生药材，购自咸阳百姓乐大药房，经陕西中医药大学生药教研室王继涛高级实验师鉴定为桑寄生科植物桑寄生的干燥带叶茎枝；对照品：芦丁，批号为MUST-14101410；实验所用试剂均为分析纯。

2实验方法2.1最大吸收波长扫描和芦丁标准曲线制作称取芦丁对照品5.0 mg，用体积分数为60%的乙醇溶解，摇匀，定容至10 mL，即得0.5 mg·mL-1的芦丁对照品溶液。

吸取0.3 mL芦丁对照品溶液，采用UV-1102型双光束紫外-可见分光光度计在400～700 nm范围内扫描，最终确定其最大吸收波长。

分别吸取芦丁对照品溶液0.3 mL，置于10 mL试管中，采用硝酸铝-亚硝酸钠(Al(NO)3-NaNO2)显色法进行显色，在最大吸收波长处测定吸光度，以吸光度A和浓度C进行线性回归，并绘制芦丁标准曲线。2.2桑寄生总黄酮得率的计算称取1.0 g桑寄生，按照常规方法提取后，采用Al(NO)3-NaNO2显色法进行显色，根据芦丁标准曲线，吸光度A计算出黄酮质量的浓度C，即桑寄生总黄酮得率Y，公式为：Y=C×N×V×10-6/m。C：黄酮的质量浓度/g·mL-1；V：滤液的体积/mL；m：样品的质量/g；N：稀释倍数。

2.3方法学考察按照 2.2项下提取方法，采用Al(NO)3-NaNO2显色法分别进行精密度实验、稳定性实验、回收率实验及重复性实验，对桑寄生总黄酮进行方法学考察研究。2.4单因素实验按照 2.2项下提取方法，在其他条件不变的情况下，分别进行乙醇体积分数、溶媒用量、提取时间及提取次数对桑寄生总黄酮得率的实验研究。

2.5响应面法优化实验以方法学及单因素实验为基础，分别考察3个因素(考察因子)，即乙醇体积分数、溶媒量及提取时间，响应值即总黄酮得率Y，采用Design-expert软件设计即3因素3水平的响应面实验，由结果最终确定桑寄生总黄酮提取的最佳工艺。

3结果

3.1芦丁对照品的最大吸收波长与标准曲线采用UV-1102型双光束紫外-可见分光光度计在400～700 nm 处进行波长扫描，最终确定最大吸收波长为506 nm。故在506 nm波长处测得芦丁线性回归方程：Y=10.086X+0.038 4(r=0.999 4)，且芦丁标准曲线线性关系良好。

3.2方法学考察

3.2.1精密度实验 称取桑寄生1.0 g，按照2.2项下提取方法，吸取6份续滤液，分别测定每份的吸光度，并计算RSD，RSD为0.099 6%，结果说明精密度良好。3.2.2稳定性实验 称取桑寄生1.0 g，按照2.2项下提取方法，分别在0.5，1，1.5，2，2.5和3 h测定其吸光度。桑寄生显色后，2 h内吸光度变化不大，表明桑寄生总黄酮显色后稳定性良好。

3.2.3加样回收率实验 称取桑寄生1.0 g，6份。按照2.2项下方法提取，分别吸取1 mL滤液，依次测定其吸光度，在另外6份滤液中分别加入5 mL芦丁对照品溶液，再分别测定其吸光度，计算回收率。由表1可知，平均回收率为98.87%，Al(NO)3- NaNO2显色法测定桑寄生中黄酮的准确度较高。

表1 加样回收率实验结果

Tab.1 The results of recovery experiment

取样量/g原有量/mg芦丁加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%1.000370.660.0571.6296.198.871.000176.610.0577.61100.298.871.000566.860.0567.89103.298.870.999570.000.0571.01101.298.871.000271.490.0572.4394.598.870.999874.460.0575.4498.098.87

3.2.4重复性提取黄酮实验结果 称取桑寄生1.0 g，6份。按照2.2项下提取方法，分别测定其吸光度，并计算RSD。RSD为0.438%，说明桑寄生总黄酮重复性较好。

3.3单因素实验结果

3.3.1乙醇对桑寄生总黄酮得率的影响 设定条件液固比为40∶1，提取时间为2 h，当乙醇体积分数小于40%时，桑寄生总黄酮得率随着乙醇体积分数的增加而增大；乙醇体积分数为40%时，桑寄生总黄酮得率达到最大值；乙醇体积分数大于40%时，桑寄生总黄酮得率下降。

3.3.2液固比对桑寄生总黄酮得率的影响 设定条件乙醇体积分数为40%，提取时间为2 h，桑寄生总黄酮得率随着液固比的增加而升高，当液固比为30∶1时，桑寄生总黄酮的得率达到了最大值，但继续增加液固比时，总黄酮得率开始下降。3.3.3提取时间对黄酮得率的影响 设定条件乙醇体积分数为40%，液固比为30∶1，当提取时间在0.5～1.5 h时，桑寄生总黄酮得率呈上升趋势，随着提取时间的延长，总黄酮得率开始下降。

3.4采用响应面法对桑寄生总黄酮提取工艺的优化

3.4.1合理选取响应面分析因素与水平3因素分别为乙醇体积分数A、液固比B及提取时间C，3因素及3水平设计见表2。

表2 实验因素水平表

Tab.2 Factors and levels of the designed experiment

水平A,乙醇体积分数/%B,液固比/mL·g-1C,提取时间/h-13030∶10.504040∶11.015050∶11.5

3.4.2响应面分析方案及结果采用Design-Expert软件对数据拟合并进而建立数学模型，见表3。

表3 响应面分析实验方案与结果

Tab.3 Experiment program and test results of RSM

实验号ABCY/%10110.9902-1-100.81031-100.84040001.12051011.1456-10-11.0307-1100.9258-1011.100910-11.0751001-10.830110001.125120001.115130001.130140001.090150-110.895161100.950170-1-10.870

3.4.3方差分析 经Design-Expert 8.05软件对实验数据进行方差分析，见表4。从表4可以看出，模拟失拟项(P=0.066 1)不显著，由此可知影响回归方程失拟平方和的主要原因是实验误差的产生。方程的模型值达极显著水平(P<0.000 1)，说明该模型用于评价实验结果的可信度较高。方程的二次项系数均为负值，表明方程有最大值。由P值可知，3个因素对桑寄生总黄酮提取率的影响排序为：提取时间>液固比>乙醇体积分数。

3.4.4响应曲面结果分析见图1～3。从图1可以看出，固定乙醇体积分数，随着液固比的升高，提取率增加，当液固比达40∶1时，提取率增加不明显；固定液固比，乙醇体积分数增加时提取率增大，当乙醇体积分数接近40%时，提取率达到最大值。由此可知，乙醇体积分数接近40%，液固比接近40∶1的区域有最大提取率。从图2可以看出，固定乙醇体积分数，随着提取时间的增加，提取率增加，当提取时间接近1 h时，提取率最大；固定提取时间，乙醇体积分数增加时提取率增大，当乙醇体积分数接近40%时，提取率最大。由此可知，乙醇体积分数接近40%，提取时间接近1 h的区域有最大提取率。从图3可以看出，固定液固比，随着提取时间的增加，提取率呈上升趋势，当提取时间接近1 h时，提取率最大；而当固定提取时间，随着液固比的增加，提取率增大，液固比接近40∶1时，提取率增加不明显。由此可知，提取时间接近1 h，液固比接近40∶1的区域有最大提取率。

表4 方差分析结果

Tab.4 Results of analysis of variance

方差来源平方和自由度均方F值P值模型0.2390.02535.46<0.0001A2.63×10-312.63×10-33.690.0963B9.80×10-319.80×10-313.750.0076C0.01310.01318.530.0035AB6.25×10-616.25×10-68.77×10-30.9280AC01001.000BC4.56×10-314.56×10-36.390.0393A21.99×10-311.99×10-32.790.1385B20.1910.19268.04<0.0001C21.92×10-411.92×10-40.270.6199残差4.99×10-377.13×10-4失拟性4.02×10-331.34×10-35.520.0661误差9.70×10-442.43×10-4总离差0.2316

图1 乙醇体积分数和液固比对桑寄生总黄酮提取率的影响

Fig.1 Effect of total flavonoids of ethanol volume fraction and liquid-solid ratio on the extraction rate

图2 提取时间和乙醇体积分数对桑寄生总黄酮提取率的影响

Fig.2 Effect of total flavonoids of extraction time and ethanol volume fraction on the extraction rate

图3 提取时间和液固比对桑寄生总黄酮提取率的影响

Fig.3 Effect of total flavonoids of extraction time and liquid-solid ratio on the extraction rate

3.4.5提取工艺条件的确定 通过对数据进行处理，得到最大提取率为1.147%，此时的最佳提取条件为：乙醇体积分数为43.11%，液固比为41.33∶1，提取时间为1.32 h。考虑到实际生产情况，确定桑寄生总黄酮提取工艺条件为：乙醇体积分数为40%，液固比为40∶1，提取时间为1 h。

3.4.6验证实验 3组平行验证实验，提取条件设定为体积分数为40%的乙醇，液固比为40∶1，提取时间为1.32 h，最终计算出桑寄生总黄酮的平均得率为1.147%。采用上述确定的工艺条件进行3次验证实验，结果3次验证实验提取率分别为1.148%,1.146%和1.146%，平均为1.146%。

4讨论

本实验通过Al(NO)3-NaNO2显色法对桑寄生总黄酮含量进行方法学考察。精密度实验RSD为0.099 6%，精密度较高；加样回收率实验结果为98.87%；显色在2 h内较为稳定。另外，对6份桑寄生总黄酮进行重复性实验，RSD为0.438%，重复性较好。

另外，单因素实验结果表明，当乙醇体积分数小于40%时，桑寄生总黄酮得率随着乙醇体积分数的增大而增加，当乙醇体积分数接近40%时，得率达到最大值，但是当乙醇体积分数大于40%时，总黄酮得率逐渐减小。响应曲面结果表明，乙醇体积分数在一定范围内，随着提取时间的延长，黄酮得率增加，但时间过长，黄酮得率会下降。

本实验采用响应面分析法优化提取条件是一种新型有效的设计方法，能准确、快速地得出提取工艺参数。本实验通过响应面图客观全面地分析了因素水平对桑寄生总黄酮提取率的影响，最终得出最佳的提取工艺为：体积分数为40%的乙醇，液固比为40∶1，提取时间为1 h。

参考文献：

[1]李永华，阮金兰，陈士林，等.中国桑寄生科Loranthaceae药用植物资源学研究进展[J]. 世界科学技术-中医药现代化，2009，11(5):665-669.

[2]龚祝南，王峥涛，徐洛珊，等.桑寄生的本草考证研究[J].时珍国医国药，1997， 8(2) :99-101.

[3]陈瑞生，陈相银，贾王俊.益肾又安胎的桑寄生[J].首都医药，2014，(17):40.

[4]刘丽娟.桑寄生现代临床应用研究进展[J].检验医学与临床，2009，6(12) :1001-1002.

[5]杨再波，杨胜峦，龙成梅，等.桑寄生中总黄酮的含量测定及抗氧化活性研究[J].食品研究与开发，2012，33(3):120-122.

[6]张志东，林少珠，吴晓松.正交实验优化桑寄生黄酮的提取工艺[J].中药材，2012，35(5):810-812.

[7]朱晓薇，刘一兵.桑寄生科植物的化学成分与抗肿瘤作用[J].国外医药·植物药分册，2001，16(4): 142-145.

[8]廖彭莹，韦东晓，杨省，等.两种不同寄主桑寄生的化学成分预实验[J].亚太传统医药， 2010，6(11):25-26.

[9]李利华.鱼腥草中总黄酮的含量测定及抗氧化性研究[J].西北药学杂志，2009，24(3):177- 180.

[10]李三华，何志全，陈全利，等.杜仲总黄酮对成骨细胞增殖及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响[J].西北药学杂志，2011，26(4):272-274.

[11]侯学敏，李林霞，张直峰，等.响应面法优化薄荷叶总黄酮提取工艺及抗氧化活性[J].食品科学，2013，34(6):124-127.

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.012

中图分类号：R284

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)04-0367-04

(收稿日期：2015-09-09)

Optimization of extraction technology of total flavonoids from Taxilli herba by design-response surface method

CHEN Rui1，YANG Fanli2，ZHANG Lin3

(1.Baoji City Chinese Medicine Hospital of Shaanxi， Baoji 721001，China；2. School of Pharmacy，Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061，China；3.Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China)

Abstract:ObjectiveTo optimize the extracting process of the total flavonoids of Taxilli herba.MethodsAccording to the center combination method，the effets of ethanol volume fraction， the ratio of solid to liquid，and the extraction time， and the extraction times were studied by central composite design.ResultsThe optimal conditions of extraction were as follows: the ethanol volume fraction was 40%，the ratio of solid to liquid was 40∶1， the extraction was 2 times，the extraction time was 1 h.ConclusionThe actual extraction yield was 1.15%.The method of extraction has higher extraction efficiency compared with other methods. And the method can provide a basis for the industrial production of the total flavonoids from Taxilli herba.

Key words:Taxilli herba；total flavonoids； extraction technique; response surface analysis