HPLC法同时测定贯叶金丝桃中芦丁、金丝桃苷和槲皮素的含量

传娟娟，张宝阳

(陕西省延安市药品检验所，延安　716000)



HPLC法同时测定贯叶金丝桃中芦丁、金丝桃苷和槲皮素的含量

传娟娟，张宝阳

(陕西省延安市药品检验所，延安716000)

摘要：目的建立贯叶金丝桃原药中芦丁、金丝桃苷和槲皮素的含量测定方法。方法样品经丙酮超声波辅助提取，采用Diamonsil®C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)分离测定；以A相乙腈-甲醇-甲酸(89.8∶10∶0.2)，B相水-甲醇-甲酸(79.8∶20∶0.2)为流动相梯度洗脱；检测波长为270 nm；流速为1.0 mL·min-1。结果芦丁的进样量在0.454～4.540 μg范围内(r=0.999 7)，金丝桃苷的进样量在0.480～4.800 μg范围内(r=0.999 2)，槲皮素的进样量在0.794～7.940 μg范围内(r=0.999 5)，都与峰面积线性关系良好。加样回收率分别为99.01%，96.04%和95.97%(n=6)。结论该方法快捷、简便，结果准确、可靠，可作为贯叶金丝桃原药中有效成分的质量控制方法。

关键词：贯叶金丝桃；芦丁；金丝桃苷；槲皮素；高效液相色谱法

贯叶金丝桃是藤黄科金丝桃属多年生草本植物HypreicumperforatumL.，其药用部位为干燥地上部分[1]；主要产地有四川、贵州、陕西、甘肃和湖南[2]。贯叶金丝桃有清热解毒、抗菌消炎、消肿止血和利湿止痛等功效[3]。目前，用贯叶金丝桃提取物制成的制剂已在欧美大量上市，广泛用于治疗轻、中度抑郁，未发现有明显的不良反应，被誉为天然氟西汀[4]。其开发应用在国际上引起了广泛的关注，成为近年来世界畅销的草药之一。

我国对于贯叶金丝桃的研究利用目前仅限于兽药和提取物(金丝桃素质量分数大于0.3%)出口。贯叶金丝桃中金丝桃素含量较低，不易测定。为了更加有效地开发贯叶金丝桃，更好地反映贯叶金丝桃药材质量，本文用HPLC法对贯叶金丝桃中芦丁、金丝桃苷和槲皮素进行含量测定，建立了一种简便、准确的测定方法。

1仪器与试药

1.1仪器Waters高效液相色谱仪(1525检测泵，2487双波长紫外检测器，Empower 色谱工作站)；数控超声波清洗器(KQ-250DE，昆山市超声仪器有限公司)；旋转蒸发器(RE-52 AAA，温州奥利生物医学仪器厂)；电子天平(BS224S，北京赛多利斯仪器有限公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，TEDIA)；水为超纯水；其余试剂为分析纯。

1.2试药金丝桃苷对照品(批号111521-200303，中国药品生物制品检定研究院)；芦丁、槲皮素对照品(由陕西科技大学生命科学与工程学院李楠老师提供，质量分数分别为98%和95.38%)；植物样品为市购，产地为甘肃武都，经西北农林科技大学生命科学学院陈彦生研究员鉴定为贯叶金丝桃。

2方法

2.1色谱条件色谱柱：Diamonsil®C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)。A相为乙腈-甲醇-甲酸(89.8∶10∶0.2)，B相为水-甲醇-甲酸(79.8∶20∶0.2)。梯度洗脱，0～5 min时A相10%，5～15 min时A相10%→40%；15～40 min时A相40%→90%；40～50 min时A相90%→100%；50～65 min时A相100%；65～66 min时A相100%→10%。检测时间：66 min；检测波长：270 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：室温；进样量：20 μL。理论塔板数按照金丝桃苷峰计算不低于3 000，金丝桃苷和芦丁峰分离度大于1.5。

2.2对照品溶液的制备精密称取对照品芦丁6.0 mg，金丝桃苷5.8 mg和槲皮素10.4 mg，置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇适量超声溶解，稀释至刻度，摇匀，用针孔滤膜(0.45 μm) 滤过，取续滤液即得。2.3供试品溶液的制备

2.3.1原药材供试品溶液的制备取贯叶金丝桃药材，粉碎，过60目筛，精密称取2.0 g，加80 mL丙酮超声提取，超声功率为200 W，超声3次，每次40 min，将所得溶液过滤，滤液浓缩至干，残渣用适量色谱甲醇溶解，定容至10 mL的棕色量瓶，用针孔滤膜(0.45 μm) 滤过，取续滤液，即为原药材供试品溶液[5]。2.3.2原药材不同部位供试品溶液的制备将贯叶金丝桃药材的茎、叶和花分别粉碎，过60目筛，各精密称取2.0 g，操作同2.3.1项下方法，即得茎、叶和花的供试品溶液[6]。

2.4线性关系考察分别精密量取2.2项下对照品溶液2，4，6，10和20 μL，注入高效液相色谱仪，按照2.1项下的色谱条件对芦丁、金丝桃苷和槲皮素进行测定，分别以进样量(μg)为横坐标X，峰面积值(A)为纵坐标Y，制作标准曲线，计算得出回归方程：Y芦丁=1 618 251.587X+421 577.874，r=0.999 7，线性范围：0.454～4.540 μg；Y金丝桃苷=3 253 070.587X+881 160.496，r=0.999 2，线性范围：0.480～4.800 μg；Y槲皮素=2 317 307.235X+260 005.032，r=0.999 5，线性范围：0.794～7.940 μg。其对照品的色谱图见图1。2.5精密度实验取2.3.1项下供试品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，每次进样20 μL，测定芦丁、金丝桃苷及槲皮素的峰面积，分别计算其RSD值为1.26%，1.31%和1.17%(n=6)，表明符合要求。2.6重复性实验取甘肃武都贯叶金丝桃药材粉末，按照2.3.1项下方法平行制备原药材供试品溶液5份，每份进样20 μL，测定芦丁、金丝桃苷及槲皮素的峰面积，分别计算其RSD值为1.59%，1.94%和1.46%(n=5)，表明该方法重复性良好。

图1对照品的色谱图

1.芦丁；2.金丝桃苷；3.槲皮素

Fig.1 The chromatogram of reference substance

1.rutin；2.hyperoside；3.quercetin

2.7稳定性实验取甘肃武都贯叶金丝桃药材粉末，按照2.3.1项下方法制备供试品溶液1份，置于棕色量瓶中，室温放置，在0，2，4，8，12和24 h分别进样20 μL，测定芦丁、金丝桃苷及槲皮素的峰面积，分别计算其RSD值为2.04%，2.36%和2.15%，结果表明供试品溶液中芦丁、金丝桃苷及槲皮素在24 h内基本稳定。

2.8回收率实验精密称取6份甘肃武都贯叶金丝桃粉末各1.0 g，加入质量浓度分别为0.203,0.232和0.416 mg·mL-1的芦丁对照品、金丝桃苷对照品和槲皮素对照品适量，依照供试品溶液的方法制备并依法测定，计算回收率，所得芦丁、金丝桃苷和槲皮素的平均回收率分别为99.01%，96.04%和95.97%，RSD值分别为1.07%，1.24%和1.59%(n=6)，结果见表1。

表1回收率结果

Tab.1 Results of recovery tests

(n=6)

2.9含量测定按照2.1项下的色谱条件，测定2.2和2.3项下的待测溶液，所得样品色谱图见图2。根据色谱图的峰面积，采用外标法计算含量，结果见表2。

从含量测定结果可知，芦丁在叶中的含量最高，金丝桃苷在花和叶中的含量远远高于茎中的含量，槲皮素在花中含量最高，叶次之，故应在花期采收地上部分；药材质量以花、叶多者为优。

表2样品测定结果

Tab.2 The determination results of samples

样品芦丁含量/mg·g-1金丝桃苷含量/mg·g-1槲皮素含量/mg·g-1全草0.3520.6450.503茎0.3840.5610.267叶0.8561.1751.105花0.2911.1831.628

图2HPLC图

A.全草； B.茎； C.叶； D.花； 1.芦丁； 2.金丝桃苷； 3.槲皮素

Fig.2 HPLC chromatograms

A.herb；B.stem；C.leaf；D.flower；1.rutin； 2.hyperoside； 3.quercetin

3讨论

色谱条件的研究：参考张俊松等[7]所用的甲醇-0.006 mol·L-1磷酸氢二钠缓冲盐(用磷酸调节pH值为6.5)梯度洗脱和郑清明等[8]所用的流动相：A相为水-乙腈-磷酸(80∶19∶1)，B相为甲醇-乙腈-磷酸(40∶59∶1)梯度洗脱，效果均不理想。参考Wenkui Li等[9]所用的流动相:A相乙腈-甲醇-三氟乙酸(89.5∶10∶0.5)，B相水-甲醇-三氟乙酸(79.5∶20∶0.5)，并将其中的三氟乙酸分别换成不同比例的甲酸和冰醋酸，结果表明，A相乙腈-甲醇-甲酸(89.8∶10∶0.2)和B相水-甲醇-甲酸(79.8∶20∶0.2)进行梯度洗脱时分离效果最好。对流动相比例和洗脱时间进行了大量研究，优选出洗脱程序。对不同检测波长(254，270，360和590 nm)进行考察，结果表明，在270 nm处分离效果较好，故将270 nm作为检测波长。考察了不同流速(0.6和1.0 mL·min-1)对峰的分离效果的影响，选用流速为1.0 mL·min-1。

实验中用HPLC法对贯叶金丝桃从原药材到不同的用药部位中3种有效成分进行了含量测定，比较系统全面地反映了贯叶金丝桃药材的内在质量。为今后贯叶金丝桃的进一步研究和开发利用提供了实验依据。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中国药典2015年版 [S].一部.北京：中国医药科技出版社，2015:231.

[2]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：北京科学出版社，1990.21.

[3]李艳，曹学丽，付鹏，等.贯叶金丝桃活性成分及其分离纯化与检测方法的研究进展[J].药学进展，2008，32(1)：15-20.

[4]王泽剑.圣约翰草提取物的临床研究[J].国外医学精神病学分册，2003，30(4)：211-213.

[5]刘超，罗晶，马辉，等.浊点萃取法提取贯叶连翘总黄酮的研究[J].西北药学杂志，2012，27(4)：296-298.

[6]曾建国，张胜，陈玉秀.HPLC法分析贯叶连翘不同部位中金丝桃素的含量[J].西北药学杂志，2000，15(4)：158.

[7]张俊松，王晓利，罗谦，等.贯叶连翘的HPLC指纹图谱[J].华西药学杂志，2006，21(5)：440-442.

[8]郑清明，秦路平，郑汉臣，等.金丝桃属植物的HPLC指纹谱研究[J].中草药，2003，34(4)：365-370.

[9]Li W,Fitzloff J F.High performance liquid chromatographic analysis of St.John′s Wort with photodiode array detection[J].J Chromatogr B Biomed Sci Appl，2001，765(1)：99-105.

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.009

中图分类号：R927.2

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)04-0356-05

(收稿日期：2015-11-23)

Simultaneous determination of rutin，hyperoside and quercetin in Hypericum perforatum by HPLC

CHUAN Juanjuan，ZHANG Baoyang

(Institute of Drug Inspection of Yan′an Shaanxi，Yan′an 716000，China)

Abstract:Objective To establish the assay of rutin，hyperoside and quercetin in raw herb of Hypericum perforatum by HPLC.Methods Samples were extracted with acetone with the assist of ultrasonic wave，separated and determined by HPLC using Diamonsil®C18column (250 mm × 4.6 mm，5 μm).Phase A acetonitrile-methanol-formic acid (89.8∶10∶0.2) and phase B water-methanol-formic acid (79.8∶20∶0.2) were used as the mobile phase at 1.0 mL·min-1and gradient elution；and detected at a wavelength of 270 nm.Results The injection amount of rutin from 0.454 to 4.540 μg(r=0.999 7)，hyperoside from 0.480 to 4.800 μg (r=0.999 2)，quercetin from 0.794 to 7.940 μg (r=0.999 5) showed good linearity with the peak area.The adding recoveries were 99.01%，96.04% and 95.97%(n=6)，respectively.Conclusion It′s a fast，simple，accurate，and reliable analysis method，which can be used to control the quality of the active components of Hypericum perforatum in the raw herb.

Key words：Hypericum perforatum；rutin；hyperoside；quercetin；HPLC