氨基化二氧化硅荧光微球的制备及其表征

刘清浩，郭金春，蔡宇廷，冷嘉鹏，刘红彦，陈立功（中北大学化工与环境学院，山西 太原 0005；河南省农业科学院植物保护研究所，河南 郑州 45000；天津大学化工学院，天津 0007）



研究开发

氨基化二氧化硅荧光微球的制备及其表征

刘清浩1，郭金春1，蔡宇廷1，冷嘉鹏1，刘红彦2，陈立功3
（1中北大学化工与环境学院，山西 太原 030051；2河南省农业科学院植物保护研究所，河南 郑州 450002；3天津大学化工学院，天津 300072）

摘要：首先合成了荧光量子产率高的不对称罗丹明衍生物，以其为荧光染料，正硅酸乙酯为硅源，在酸性条件下，运用包埋法制备了二氧化硅荧光微球。然后采用硅烷偶联剂氨丙基三乙氧基硅烷，在二氧化硅荧光微球表面引入氨基功能基团。通过扫描电镜、荧光显微镜、红外光谱仪、荧光分光光度计对氨基化二氧化硅荧光微球的形貌、结构和荧光性能进行了表征。结果表明，氨基化二氧化硅荧光微球具有良好的单分散性，粒径分布窄，荧光性能好且稳定，并成功的引入氨基基团。

关键词：二氧化硅；制备；有机化合物；氨基化荧光微球；不对称罗丹明衍生物

功能化荧光微球是指微球的表面标有荧光物质或微球体内结构含有荧光物质的微球，受到外界能量刺激能激发出荧光，其载体多为有机或无机聚合物材料。目前，功能化荧光微球以其独特的光学与材料学性能，在高通量药物筛选、分子示踪[1]、免疫检测[2]、基因研究[3]等领域表现出巨大的应用潜力。罗丹明荧光染料以其优良的光学性能常用来制备荧光微球，但本身的斯托克斯位移小，降低了检测的分辨率，限制其在许多研究领域的进一步应用[4]。据文献报道，罗丹明衍生物的不对称结构有利于增加斯托克斯位移[5]。为此，本文设计合成出光学性能优异的不对称罗丹明衍生物，并将其作为微球的荧光染料。此外，无机材料二氧化硅具有许多高分子材料无法比拟的特性[6]，如物理刚性、化学稳定性、在溶剂中可忽略的溶胀性、无毒性、胶体稳定性、高生物相容性、优异的光学透光性及表面易功能化的特性，尤其是表面氨基化的二氧化硅微球，其活性氨基可以和多种无机离子或无机、有机、生物分子发生反应，在生物化学、分析、催化、工业和电子学等领域具有广泛的应用前景。因此，本文选用二氧化硅微球作为载体，以不对称罗丹明衍生物作为荧光染料，在酸性条件下采用包埋法制备了二氧化硅荧光微球[7-10]。然后以硅烷偶联剂氨丙基三乙氧基硅烷（KH-550）为改性剂，在二氧化硅荧光微球表面引入了功能基团。本文制备的二氧化硅荧光微球是将荧光物质完全包埋在微球内部，使其不会受到任何外部因素的影响，从而保障了微球荧光强度的稳定性，很好地解决了物理吸附荧光染料所产生的缺点。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

SU-500型扫描电子显微镜（日本电子）、DM6000-B荧光显微镜（德国Leica）、岛津8400S FTIR光谱仪、Cary Eclipse型荧光分光光度计（美国Varian公司生产）和UV2450紫外-可见分光光度计（日本岛津）。

正硅酸乙酯（TEOS，AR）、氨丙基三乙氧基硅烷（KH-550，AR）、冰乙酸（CH3COOH，AR）、甲苯（AR）。

1.2 不对称罗丹明衍生物的合成

吡咯烷基酮酸的合成如式(1)。

向装有电磁搅拌的 100mL四口烧瓶中加入吡咯烷基酚 1.20g（7.36mmol），邻苯二甲酸酐 1.31g （8.83mmol）和甲苯（40mL）。在N2保护下，搅拌至部分溶解后升温回流，反应 4h后降温至 50～60℃，加入w(NaOH)=35%的水溶液7.00mL，在90℃下反应6h。将反应液倒入70mL水中，缓慢滴入浓盐酸进行酸化至pH < 3，析出黄褐色粉末，静置2h后抽滤。滤饼先用冷水洗至中性，抽滤，然后用甲醇的水溶液（水∶甲醇= 1∶1，体积比）重结晶，得淡黄色柱状晶体，即吡咯烷基酮酸（1.63g，71.35%）。

不对称罗丹明衍生物的合成如式(2)。

向装有电磁搅拌的100mL四口烧瓶中加入吡咯烷基酮酸 0.31g（1.00mmol），间 N，N-二甲氨基苯酚0.17g（1.25mmol）和甲基磺酸5mL。在N2保护下，加热至85℃反应。14h后停止反应，降至室温后加入50mL冰水，用饱和碳酸钠溶液中和至pH=5，过滤，将滤饼真空干燥得粗品。干法上样经柱层析（甲醇∶二氯甲烷=1∶20，体积比）分离，得不对称罗丹明（0.31g，72.83%）。

1H NMR (300MHz，CD3OD)：δ 2.04～2.10 (m，4H)，3.23～3.33 (m，4H)，3.55 (s，6H)，6.73～6.97 (m，3H)，7.17～7.27 (m，3H)，7.67～7.76 (m，3H)，8.18 (d，J = 7.2Hz，1H)。

图1 包埋法制备SiO2荧光微球的示意图

图2 不对称罗丹明衍生物和罗丹明B在乙醇溶液中的紫外-可见光谱和荧光发射光谱图

1.3 SiO2荧光微球的制备

在 100mL四口烧瓶中加入一定量的正硅酸乙酯（TEOS）、冰乙酸（CH3COOH）搅拌5min后，再加入一定量的不对称罗丹明衍生物的水溶液。在室温下磁力搅拌10min，并静置20min后，抽滤出SiO2荧光微球，并用去离子水、乙醇反复洗涤微球，直至洗涤液中不再检测出荧光为止，最后用丙酮洗涤，在50℃下真空干燥即得SiO2荧光微球。其中正硅酸乙酯（TEOS）∶冰乙酸（CH3COOH）∶水（H2O）=1∶4∶4（摩尔比），不对称罗丹明衍生物的量为0.08～0.10g。

图1是采用包埋法制备SiO2荧光微球的反应示意图[7，10]。

1.4 氨基化SiO2荧光微球的制备

取0.5g SiO2荧光微球置于100mL四口瓶中，加入25mL无水甲苯，0.5mL氨丙基三乙氧基硅烷（KH-550），超声混合15min后，110℃冷凝回流，磁力搅拌 12h。反应结束后，依次用去离子水、乙醇、丙酮反复洗涤微球，50℃真空干燥即得氨基化SiO2荧光微球。

2 结果与讨论

2.1 不对称罗丹明和罗丹明B的光学性能

图3 不对称罗丹明衍生物（A）和罗丹明B（B）在乙醇溶液中的荧光发射光谱图

图2是不对称罗丹明衍生物和罗丹明B在乙醇溶液中的紫外-可见光谱和荧光发射光谱图。由图2(a)和图 2(b)可知，不对称罗丹明衍生物的最大激发波长为541nm，最大发射波长为564nm；罗丹明B的最大激发波长为 544nm，最大发射波长是为565nm，由文献[11]报道的斯托克斯位移（Stokes shift）公式，得出不对称罗丹明衍生物的斯托克斯位移是754cm–1，而罗丹明B是683cm–1。图3是不对称罗丹明衍生物和罗丹明B在乙醇溶液中的荧光发射光谱图，以罗丹明 B（乙醇溶液， λex=450～565nm，φstandard=0.50[11]）为标准，选择500nm为激发波长，由文献[11]报道的量子产率公式得到不对称罗丹明的量子产率为0.70。

图4 二氧化硅荧光微球的扫描电镜和荧光显微镜图

由上述分析可知，不对称罗丹明衍生物具有优异的光学性能，其斯托克斯位移和量子产率均高于罗丹明B，因此本文将不对称罗丹明衍生物作为制备二氧化硅荧光微球的荧光染料。

2.2 二氧化硅荧光微球的形貌

图4(a)和图4(b)是二氧化硅荧光微球的扫描电镜图，可以看出所制备的二氧化硅荧光微球粒径分布窄、单分散性良好。图4(c)和(d)是二氧化硅荧光微球的荧光照片，可以看出二氧化硅荧光微球荧光强度强，具有好的光稳定性。

正如图1所示，前体正硅酸乙酯在酸性条件下水解成球的过程中，生成的中间体硅胶基质带有负电荷。而荧光染料不对称罗丹明衍生物带有正电荷，能与电负性的硅胶基质通过静电作用力将不对称罗丹明衍生物分子牢牢地固定在微球中，解决了荧光染料分子泄漏的问题[10，12]，从而保证二氧化硅荧光微球的荧光强度高且稳定。

图5 二氧化硅荧光微球（A）和氨基化二氧化硅荧光微球（B）的红外光谱图

2.3 氨基化二氧化硅荧光微球的FTIR和荧光光谱

图5是二氧化硅荧光微球（A）和氨基化二氧化硅荧光微球（B）的红外光谱图，从图5可以看出，二氧化硅荧光微球和氨基化二氧化硅荧光微球在 1100cm–1处均有 Si—O—Si键的骨架伸缩振动峰，947cm–1处是Si—OH的弯曲振动吸收峰，455cm–1处是Si—O—Si的弯曲振动吸收峰，这说明二氧化硅荧光微球和氨基化二氧化硅荧光微球均由Si—O—Si的网络结构组成。图5中曲线B为3-氨丙基三乙氧基硅烷（KH550）改性的二氧化硅红外光谱图，可以看出在2940cm–1处有很弱的吸收峰，这分别是亚甲基和甲基中C—H的伸缩振动峰；在3458cm–1处有一个吸收峰，与二氧化硅的Si—OH相比该峰明显宽了许多，这主要是因为KH550中的N—H的不对称伸缩振动峰与二氧化硅中的Si—OH峰相互重叠造成的。上述结果已充分证明二氧化硅荧光微球表面接枝上了KH550。

图6是氨基化二氧化硅荧光微球和不对称罗丹明衍生物的荧光发射光谱图，可以看出氨基化二氧化硅荧光微球的发射波长比不对称罗丹明衍生物稍微发生了红移，这可能是由于氨基化二氧化硅荧光微球中的不对称罗丹明衍生物和 Si—OH之间以SiO–…不对称罗丹明衍生物+或者SiO–…[(不对称罗丹明衍生物二聚体)2+]…–OSi的形式存在相互作用[9]，使不对称罗丹明衍生物在微球中形成二聚体乃至多聚体，导致单体激发态能级的分裂，使得多聚体荧光的上能级低于单体，因此，与单体不对称罗丹明衍生物相比，氨基化二氧化硅荧光微球表现出红移。

图6 氨基化二氧化硅荧光微球（A）和不对称罗丹明衍生物（B）水溶液中的荧光发射光谱图

3 结 论

（1）合成出荧光性能优异的荧光染料-不对称罗丹明衍生物。

（2）在酸性条件下，采用包埋法制备得到单分散性好、粒径分布窄、荧光强度高且稳定的二氧化硅荧光微球，并在二氧化硅荧光微球表面接枝上氨丙基三乙氧基硅烷。

（3）氨基化二氧化硅荧光微球表面带有正电荷，可强烈结合带负电荷的蛋白质、DNA或药物分子。

参考文献

[1] 吴清平，马延霞，张菊梅，等.香豆素类荧光底物的合成及其在微生物检测中的应用进展[J].化工进展，2014，33（9）：2444-2449.

[2] JANNE O K.Fluorescent nanoparticle as labels for immunometric assay of C-reactive protein using two-photon excitation assay techmology[J].Analytical Biochemistry，2004，328：210-218.

[3] GAO Y L，WILLIAM L S，WARREN C W C.Quantum-dot-encoded microbeads for multiplexed genetic detection of non-amplified DNA samples[J].Small，2011，7：137-146.

[4] BRINKLEY J M，HAUGLAND R P，SINGER V L.Fluorescent microparticles with controllable enhanced Strokes shift: US 5326692 [P].1994-05-20.

[5] MATTHEW A C，KATHRYN D，JYOTI T，et al.Synthesis and metal-binding properties of chelating fluorescein derivatives[J].Org.Lett.，2003，5（12）：2051-2054.

[6] 苏二强，高春苹，董晋湘.牙膏磨擦剂二氧化硅制备条件的优化[J].化工进展，2014，33（6）：1545-1550.

[7] KARMAKAR B，DE G GANGULI D.Silica microspheres from the system tetraethyl orthosilicate- acetic acid- water [J].Journal of non-Crystalline Solids，1991，135：29-36.

[8] KARMAKAR B，DE G，GANGULI D.Dense silica microspheres from organic and inorganic acid hydrolysis of TEOS[J].Journal of non-Crystalline Solids，2000，272：119-126.

[9] YANG H，VOVK G，COOMBS N，et al.Synthesis of mesoporous silica spheres under quiescent aqueous acidic conditions [J].J.Mater.Chem.，1998，8（3）：743-750.

[10] TAICHI M，YASUSHI T，HIROAKI O，et al.Synthesis of rhodamine B-doped and monodispersed spherical particles of polyorganosiloxane using a W/O emulsion[J].Journal of the American Ceramic Society，2005，88（12）：3458-3468.

[11] 刘清浩.罗丹明、荧光素、尼罗红及尼罗兰衍生物的合成及应用[D].天津：天津大学，2009.

[12] HUO，Q，LIU J，FANG E，et al.A new class of silica cross-linked micellar core-shell nanoparticles [J].J.Am.Chem.Soc.，2006，128：6447-6453.

第一作者及联系人：刘清浩（1979—），女，博士，讲师，主要从事新型荧光功能材料合成、性能和生物应用的研究。E-mail liuqinghao0205@126.com。

中图分类号：O 635.2

文献标志码：A

文章编号：1000-6613（2016）07-2130-05

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.07.027

收稿日期：2015-08-12；修改稿日期：2016-04-03。

基金项目：省级大学生创新创业训练项目（1504211303）和2015校学科研究基金项目（110246）。

Preparation and characterization of silica fluoresent microspheres with amino groups

LIU Qinghao1，GUO Jinchun1，CAI Yuting1，LENG Jiapeng1，LIU Hongyan2，CHEN Ligong3
（1School of Chemical Engineering and Environment，North University of China，Taiyuan 030051，Shanxi，China;2Institute of Plant Protection，Henan Academy of Agriculture Sciences，Zhengzhou 450002，Henan，China；3School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

Abstract：Asymmetrical rhodamine derivative was firstly synthesized with a yield of high fluorescence quantum.Using asymmetrical rhodamine derivative as fluoresent dye，tetraethyl orthosilicate as the raw material，we prepared silica fluoresent microspheres by embedding method under acidic solutions.Then surface modification on the silica fluoresent microspheres by aminopropyl triethoxysilane was carried out.Finally，silica fluorescent microspheres with amino groups were characterized by scanning electron microscopy，fluorescence microscopy，fourier transform-infrared spectroscopy and fluorescence spectrophotometry.The results indicated that the obtained silica fluorescent microspheres were of good dispersion，narrow particle size，stable and high fluorescence intensity.And amino groups were successfully introduced on the surface.

Key words:silica; preparation；organic compounds；fluoresent microspheres with amino groups；asymmetrical rhodamine derivative