内质网应激基因在牛健康和闭锁卵泡中的差异表达研究

吐逊·吾守尔（新疆阿瓦提县畜禽改良站，新疆　阿瓦提　843200）



内质网应激基因在牛健康和闭锁卵泡中的差异表达研究

吐逊·吾守尔
（新疆阿瓦提县畜禽改良站，新疆阿瓦提843200）

摘 要：为了初步探究内质网应激在牛卵泡闭锁过程中起到的作用，实验采用荧光定量PCR（qRT-PCR）方法对健康卵泡及闭锁卵泡中内质网应激相关基因的表达情况进行了研究。结果表明：闭锁卵泡颗粒细胞中内质网应激相关基因Atf4，Atf6，Grp78，Grp94，Xbp1，Chop，Caspase12的表达均显著高于健康卵泡。说明内质网应激参与了牛卵泡闭锁的发生，为研究牛卵泡闭锁及卵泡选择的分子机制提供了重要参考价值。

关键词：内质网应激；基因表达；牛卵泡闭锁；颗粒细胞凋亡

10.16863/j.cnki.1003-6377.2016.03.004

前言

内质网应激（ERS）是指在缺氧、氧化应激、异常糖基化反应以及钙离子稳态失衡情况下，内质网未折叠的蛋白质会明显增多，当超出内质网处理能力时，细胞激活一些相关信号级联合反应来应对条件的变化和恢复内质网良好的蛋白质折叠环境。一般用参与非折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response,UPR）的标志性分子来提示ERS的发生，PERK，IRE-1，ATF6是内质网应激的三条信号通路的重要分子，BiP和XBP-1表达上调常被用作ERS的标志。研究表明发生ERS的细胞能调节ERS相关促凋亡分子如CHOP 和caspase-12等和促存活分子如GADD34和BiP等的表达/活化，最终决定细胞是适应还是凋亡[1]。在发生内质网应激条件下，PERK与分子伴侣Grp78分离而活化，并引起其下游eIF2α磷酸化而失活，终止细胞内绝大部分蛋白质的合成，但能够激活ATF4的表达，进而引起CHOP表达量上调[2]。

哺乳动物卵泡在发育过程中75%～99%的会发生闭锁，仅仅少量的卵泡会成熟并排卵，然而不正常的闭锁会导致繁殖力的过早终结[5]。卵泡的闭锁主要是由颗粒细胞凋亡导致的[3,4]，卵巢颗粒细胞的正常功能对于卵母细胞成熟至关重要，而颗粒细胞功能的紊乱会导致生育能力的丧失[6]。目前已经有关于内质网应激影响小鼠、山羊卵巢颗粒细胞凋亡的报道[7,8]，但是深层机制还没有得以揭示。同时，内质网应激是否参与了牛卵巢颗粒细胞的凋亡过程国内外还没有相关报道。为此，本实验利用荧光定量PCR技术分析了内质网应激相关基因在健康卵泡及闭锁卵泡中的表达情况，以探究内质网应激是否参与了牛卵泡颗粒细胞凋亡过程。

1　材料与方法

1.1实验材料及试剂

恒温水浴锅，超净工作台，自动灭菌锅，高速冷冻离心机，伯乐CFX96实时定量PCR仪，EvaGreen Master MIX荧光定量试剂盒，Dnase I，EDTA，Millipore超纯水仪，20 mL医用注射器，体视显微镜，洗卵液TCM199（含有hepes），Trizol，双抗，PBS等。

1.2实验方法

1.2.1牛卵巢颗粒细胞采集

屠宰场收集牛卵巢，置于30℃～35℃的生理盐水，2 h内运回实验室。生理盐水洗三遍，使用18 g针头的注射器针刺破卵泡，释放出壁层颗粒细胞，将所采集的卵泡液置于15 mL离心管内。置于离心机中1 000 rpm离心5 min，用PBS悬浮细胞后1 000 rpm离心5 min，PBS清洗重复两次，最后将细胞用1 mL Trizol裂解，-20℃保存用于RNA提取。本研究中每一个颗粒细胞样品重复来自于4～6个健康卵泡或闭锁泡，实验至少重复3次。

1.2.2细胞总RNA的提取及反转录

按照Trizol提取RNA说明书方法提取颗粒细胞总RNA。以所提颗粒细胞总RNA为模板，使用iScript cDNA Synthesis kit反转录试剂盒，按照其说明书方法去除基因组DNA并反转录。反转录完成后，将获得的cDNA置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.3荧光定量

根据EvaGreen Master MIX荧光定量试剂盒说明书，设定实时定量PCR反应的体系及程序设定。反应体系为EvaGreen Master MIX 5 μL，上下游引物各1 μL，颗粒细胞细胞cDNA 1 μL，Rnase-free H20 2 μL。PCR反应程序为预变性95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，40个循环。根据NCBI数据库各基因的CDS序列,利用利用primer 5.0设计引物，Atf4上下游引物序列分别为5'-CAGCAAGGAGGATGCTTTCT -3'和5'-GCATGGTTTCCAGGTCATCT-3'；Atf6上 下 游 引物 序 列 分别 为5'-AAGTGGAAAGGACCAAGTCAAG-3'和5'-GCCATGAGCTGAGAATTTGAG-3'；Grp78上下游引物序列分别为5'-TGAGCCTACGGCAGCTGCTAT-3'和5'-TGGTGAGAAGGGACACATCAAAG-3'；Grp94上下游引物序列分别为5'-CCCGATGCAAAGGTGGAA-3'和5'CCCGCATCCATTTCTTCGT-3'；Chop上 下游 引 物 序 列分 别 为5'-GGAGGTGCTGTCCTCAGATG-3'和5'-CAGAGAGGCAGGGTCAAGAGT-3';Xbp1上下游引物序列分别为5'-GGCAGAGACCAAGGGGAATG -3'和 5'-GGGTCGACTTCTGGGAGCTG-3';Caspase12上下游引物序列分别为 5'-GCCC TCATCATCTGCAACAA-3'和5'-GACGGCCAGC AAACTTCATT-3';内参基因Gapdh上下游引物序列分别为5'-TGGTGAAGGTCGGAGTGAAC-3'和5'-GGAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。

1.2.4数据统计与分析

实时荧光定量PCR的结果利用2-△ct法计算健康组与闭锁卵卵泡颗粒细胞内内质网应激基因相对表达量，所得实验数据使用Minitab 17软件进T检验分析，数据表示为Mean±SEM表示。

2　结果与分析

2.1健康卵泡与闭锁卵泡的识别

健康卵泡的卵泡内膜上分布较多的红色血管，发育良好，其卵泡液澄清透明并且不含杂质；闭锁卵泡的内膜发生不同程度的白化现象，并其卵泡液浑浊，含有较多的脱落颗粒细胞[9]。两种卵泡形态见图1。

图1　健康（Healthy）和闭锁卵泡（Atretic）的形态

2.2主要内质网应激基因的溶解曲线

参与内质网应激反应的主要基因的溶解曲线如图2。由图中可见这几个基因的溶解曲线都为单峰，证明PCR产物单一无杂带。

图2　主要内质网应激基因的溶解曲线

2.3内质网应急基因在健康及闭锁卵泡颗粒细胞间的表达差异

两种卵泡提取RNA，反转录cDNA，使用荧光定量仪检测几种主要的参与内质网应激反应的基因表达量差异，由图3可知细胞内参与内质网应激的基因在牛闭锁卵泡中的表达含量均比健康卵泡显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)。

图3　内质网应急基因在健康及闭锁卵泡颗粒细胞间的表达差异

3　讨　论

牛卵泡发育过程中要经过募集、选择、择优等一系列的复杂生物学事件[10]，其中卵泡发育的每个时期均会有卵泡闭锁的发生。卵泡闭锁主要是由卵泡颗粒细胞凋亡导致的，而内质网应激是细胞发生凋亡的诱因之一[11]。CHOP与Caspase12是内质网应激反应导致细胞凋亡的下游基因；PERK与Grp78分离会激活ATF4的表达，进而上调CHOP转录；ATF6能结合至内质网应激元件基因的启动子区域，并活化这些基因最终激活CHOP的转录；ATF6的活化也会激活XBP1基因的转录；XBP1mRNA经IRE1剪接后的XBP1蛋白可以增强分子伴侣蛋白BIP的转录活性，增加错误折叠糖蛋白的降解；XBP1剪切体的升高表明细胞内内质网应激反应强度的增强。本研究中，闭锁卵泡颗粒细胞内Xbp1剪切体表达量显著高于健康卵泡内含量（P<0.01)，说明牛闭锁卵泡颗粒细胞内质网应激反应强度高于健康卵泡，由此推断细胞内过强的内质网应激反应可能是导致颗粒细胞凋亡的原因之一。同时，CHOP及Caspase12为内质网应激反应导致细胞凋亡的最终执行分子，二者在牛闭锁卵泡颗粒细胞内表达也显著高于健康卵泡颗粒细胞P< 0.05和P<0.01)，与Yang[8]等人在小鼠凋亡颗粒细胞中的结果一致。Atf4及Atf6作为内质网应激反应的上游调控基因，在牛闭锁卵泡颗粒细胞内表达显著高于健康卵泡颗粒细胞内含量（<0.01)。因此，本研究表明内质网应激反应参与了牛卵泡发育过程中卵泡闭锁事件，可能是导致由牛卵泡颗粒细胞凋亡引起的卵泡闭锁的原因之一。

参考文献:

[1]钟卫卫，林世德.内质网应激与肝损伤研究进展[J].世界华人消化杂志,2010，(10):1021-1025.

[2]Banhegyi,G.,et al.,Endoplasmic reticulum stress[J].Ann N Y Acad Sci,2007，（1113）:58-71.

[3]Hughes,F.J.and W.C.Gorospe,Biochemical identification of apoptosis(programmed cell death)in granulosa cells:evidence for a potential mechanism underlying follicular atresia[J].Endocrinology, 1991,129(5):2415-22.

[4]RAJAKOSKI,E.,The ovarian follicular system in sexually mature heifers with special reference to seasonal,cyclical,end left-right variations[J].Acta Endocrinol Suppl(Copenh),1960，34(Suppl 52):1-68.

[5]Johnson,A.L.,Granulosa cell apoptosis:conservation of cell signaling in an avian ovarian model system[J]. Biol Signals Recept,2000，9(2):p.96-101.

[6]Su,Y.Q.,K.Sugiura and J.J.Eppig,Mouse oocyte control of granulosa cell development and function: paracrine regulation of cumulus cell metabolism[J].Semin Reprod Med,2009，27(1):p.32-42.

[7]Lin,P.,et al.,Endoplasmic reticulum stress is involved in granulosa cell apoptosis during follicular atresia in goat ovaries[J].Mol Reprod Dev,2012，79(6):p.423-32.

[8]Yang,Y.,et al.,Luman recruiting factor regulates endoplasmic reticulum stress in mouse ovarian granulosa cell apoptosis[J].Theriogenology,2013，79(4):p.633-9.e1-3.

[9]Boni,R.,A.Cuomo and E.Tosti,Developmental potential in bovine oocytes is related to cumulus-oocyte complex grade,calcium current activity,and calcium stores[J].Biol Reprod,2002，66(3):p.836-42.

[10]张运海.牛卵泡发育及其调控[J].动物科学与动物医学,2000,(04):15-18.

[11]Hassan,M.,et al.,Endoplasmic reticulum stress-mediated pathways to both apoptosis and autophagy: Significance for melanoma treatment[J].World J Exp Med,2015，5(4):p.206-217.

中图分类号：S827

文献标识码：A

文章编号：1003-6377（2016）03-0017-05

基金项目：国家“十二五”肉牛产业体系项目。

作者简介：吐逊·吾守尔（1964-），男（维吾尔族），在职硕士，高级畜牧师，研究方向为动物遗传育种与繁殖。E-mail:20850920@qq.com

收稿日期：2016-02-15修回日期：2016-02-24

Study on Expression Difference of Endoplasmic Reticulum Stress Genes between Bovine Healthy and Atretic Follicles

TUXUN·Wushouer
（Xinjiang Awati County Animal and Poultry Station,Awat Xinjiang 843200,China）

Abstract:To preliminarily explore the role of endoplasmic reticulum stress bovine follicular atresia,we use fluorescence quantitative PCR(qRT-PCR)to detect the expression of several genes which are involved in endoplasmic reticulum stress between bovine healthy and atretic follicles.The results show that:The expression of Atf4,Atf6,Grp78,Grp94,Xbp1,Chop,Caspase12 in atretic follicles are significantly higher than the one in healthy follicles.It is suggested that endoplasmic reticulum stress may account for the bovine follicular atresia to some extent,and this study provides important reference to the investigation of molecular mechanisms of bovine follicular atresia and follicle selection.

Key words:endoplasmic reticulum stress;genes expression;bovine atretic follicles;granulosa cells apoptosis