RNA干扰下调MBP⁃1对骨肉瘤Saos⁃2细胞生物学的影响

施鑫鹤，耿晢，施星臣，马克君，朱宏文，任雯，周雅丽

（1.兰州大学第二医院中心实验室，兰州 730030；2.兰州大学基础医学院生物化学及分子生物学研究所，兰州 730000；3.兰州第二人民医院骨科，兰州 730030）



RNA干扰下调MBP⁃1对骨肉瘤Saos⁃2细胞生物学的影响

施鑫鹤1，耿晢2，施星臣3，马克君1，朱宏文1，任雯1，周雅丽1

（1.兰州大学第二医院中心实验室，兰州 730030；2.兰州大学基础医学院生物化学及分子生物学研究所，兰州 730000；3.兰州第二人民医院骨科，兰州 730030）

摘要目的探讨c⁃myc启动子结合蛋白1（MBP⁃1）基因沉默对人骨肉瘤Saos⁃2细胞生长的影响。方法实验分为3组：正常对照组（未转染骨肉瘤细胞）、阴性对照组（转染错义序列组）和沉默组（转染MBP⁃1shRNA组）。设计2条MBP⁃1基因的RNA干扰片段及1条阴性对照siRNA，并与pSIREN⁃retroQ质粒连接。将重组pSIREN⁃retroQ质粒通过Lipofectamine 2000脂质体转染骨肉瘤Saos⁃2细胞。实时PCR和Western blot分别检测MBP⁃1表达。CCK⁃8法对MBP⁃1沉默后骨肉瘤Saos⁃2细胞生长进行检测。Western blot检测对照组和沉默组cyclin D1和cyclin E的表达。结果通过PCR扩增及测序，说明已成功构建MBP⁃1沉默及对照重组pSIREN⁃retroQ质粒。实时PCR结果显示，沉默组MBP⁃1mRNA相对表达量与对照组相比显著下调（P＜0.05）。Western blot结果显示，沉默组MBP⁃1蛋白表达量与对照组相比也显著下调。CCK⁃8法结果表明，沉默组细胞在48、72和96 h时增殖能力均比对照组显著升高（P＜0.05）。沉默组cyclin D1和cyclin E的表达显著高于对照组（P＜0.05）。结论MBP⁃1基因沉默后骨肉瘤Saos⁃2细胞生长被明显促进，为寻找骨肉瘤基因治疗新靶点打下基础。

关键词骨肉瘤Saos⁃2细胞；RNA干扰；c⁃myc启动子结合蛋白1；细胞生长

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骨肉瘤是一种临床常见恶性骨肿瘤［1］，起源于间叶组织，约占所有骨肿瘤的20%。骨肉瘤好发于青少年，具有恶性程度高、预后差等特点。传统骨肉瘤治疗主要是手术和化疗，但其最后疗效不佳。随着分子生物学等相关学科的兴起与发展，基因治疗骨肉瘤越来越受到重视。目前，基因治疗特别是癌基因和抑癌基因水平的治疗，与传统的手术治疗和化疗相结合，使得骨肉瘤的治疗效果有了显著提升。在这些肿瘤基因治疗研究中，癌基因c⁃myc是一种被广泛关注的能够促进肿瘤发生并产生相应后续结果的基因。c⁃myc基因表达一种转录因子，通过改变很多肿瘤细胞生物学功能，如增殖、侵袭、转移及对凋亡的敏感性等，导致肿瘤发生［2］。目前的研究也已经证明c⁃myc在很多种人类肿瘤中显著升高，充分表明其在肿瘤发生发展中的重要作用。一种最早在人子宫颈癌HeLa细胞中发现的c⁃myc启动子结合蛋白1（c⁃mycpromoter binding protein 1，MBP⁃1）被证实是一种能在转录水平对癌基因c⁃myc表达进行抑制的蛋白质［3］。已知MBP⁃1结合到c⁃myc基因P2启动子上［4］，通过抑制癌基因c⁃myc过度表达，特异地抑制肿瘤发生发展的生物学效应。本研究通过RNA干扰下调骨肉瘤Saos⁃2细胞中MBP⁃1的表达，以了解MBP⁃1基因下调对骨肉瘤的影响，为寻找骨肉瘤基因治疗新靶点及深入研究打下基础。

1　材料与方法

1.1材料

人骨肉瘤Saos⁃2细胞，购自中国科学院上海细胞库。DMEM培养液、胎牛血清及opti⁃MEM培养液，购自美国Gibco公司。RNA干扰质粒pSIREN⁃retroQ（含嘌呤霉素筛选标记）、逆转录试剂盒、实时PCR试剂盒及感受态JM109工程菌，购自大连TaKa⁃Ra公司。引物、质粒小量提取试剂盒、去毒素质粒提取试剂盒、RIPA裂解液，购自上海生工生物工程技术服务有限公司。RNA抽提试剂Trizol、脂质体LipofectionTM2000，购自美国Invitrogen公司。MBP⁃1兔抗人多克隆抗体，购自美国Abcam公司。兔抗人多克隆cyclin D1，购自美国Abcam公司。兔抗人cyclin E，购自美国Santa Cruz公司。人β⁃actin、山羊抗兔辣根过氧化物酶、ECL化学发光试剂盒，购自上海鼎国生物技术有限公司。CCK⁃8试剂盒，购自日本同仁株式会社化学研究所。

1.2实验方法

1.2.1RNA沉默质粒设计：针对MBP⁃1沉默序列及阴性对照序列委托大连TaKaRa公司设计合成，干扰靶序列1（CTE954⁃1）为GCAACTCTGAAGTCATCC TGC；正义链，GATCCGCAACTCTGAAGTCATCCTG CTTCAAGAGAGCAGGATGACTTCAGAGTTGCTTT TTTG；反义链，AATTCAAAAAAGCAACTCTGAAGT CATCCTGCTCTCTTGAAGCAGGATGACTTCAGAGT TGCG。干扰靶序列2（CTE954⁃3）为GCATTGGAGC AGAGGTTTACC；正义链，GATCCGGACTACCCAGT GGTGTCTATTTCAAGAGAATAGACACCACTGGGT AGTCCTTTTTTG；反义链，AATTCAAAAAAGGACT ACCCAGTGGTGTCTATTCTCTTGAAATAGACACCA CTGGGTAGTCCG。同时设计阴性序列对照质粒（CTE954⁃N），靶序列为GTACCTCTAGCGATCAAACG A；正义链，GATCCGTACCTCTAGCGATCAAACGAT TCAAGAGATCGTTTGATCGCTAGAGGTACTTTTTT G；反义链，AATTCAAAAAAGTACCTCTAGCGATCA AACGATCTCTTGAATCGTTTGATCGCTAGAGGTAC G。引物退火后将退火产物分别与pSIREN⁃retroQ （BamHⅠ/EcoRⅠ）载体连接，转化感受态JM109工程菌。用引物pSIREN正义链和pSIREN反义链对阳性克隆进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。引物序列为pSIREN正义链，TGGATGTGG AATGTGTGCGA；pSIREN反义链，TTTGTACACCC TAAGCCTCC。此外为保证干扰质粒准确设计与构建，用U6正义链、pSIREN正义链引物对阴性对照和沉默质粒进行测序。U6正义链测序引物序列为CTTGAACCTCCTCGTTCGACCCCGCCTC。RNA沉默序列设计及后续相应干扰载体选择、阳性克隆电泳及质粒测序均由大连TaKaRa公司提供并完成。

1.2.2人骨肉瘤细胞培养：人骨肉瘤Saos⁃2细胞系于含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液中，5% CO2、37℃环境条件下连续培养。

1.2.3RNA沉默及对照骨肉瘤Saos⁃2细胞获取：实验细胞分为3组：（1）正常对照组，即骨肉瘤Saos⁃2细胞；（2）阴性对照，质粒为pSIREN⁃retroQ阴性对照CTE954⁃N；（3）沉默组，质粒分别为pSIREN⁃retroQ干扰质粒CTE954⁃1和CTE954⁃3。将阴性对照质粒及2条沉默质粒通过LipofectionTM2000分别转染人骨肉瘤Saos⁃2细胞，具体方法参见脂质体Lipofec⁃tionTM2000转染说明书，获得正常对照组、阴性对照组和2个沉默组骨肉瘤Saos⁃2细胞。

1.2.4实时定量PCR检测MBP⁃1表达：取正常对照组、阴性对照组和2个沉默组骨肉瘤Saos⁃2细胞，RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，逆转录试剂盒获得cDNA，具体方法参照逆转录试剂盒说明书。取cDNA产物，实时PCR扩增检测MBP⁃1基因表达，具体方法参照大连TaKaRa公司实时定量PCR操作说明书。MBP⁃1引物序列，F，CGTTCAATGTCATCAAT GGCGGT；R，CTTCAGGTTGTGGTAAACCTCTG。实时定量PCR内参人GADPH序列，F，AACAGCCTCA AGATCATCAGCAA；R，GAGTCCTTCCACGATACC AAAGT。实验重复3次，结果取平均值。

1.2.5Western blot检测MBP⁃1蛋白表达：取正常对照组、阴性对照组和2个沉默组骨肉瘤 Saos⁃2细胞，SDS⁃PAGE电泳，转膜，一抗1∶500稀释于5%脱脂奶粉，4℃孵育过夜；辣根过氧化物酶标记的二抗1∶500稀释于5%脱脂奶粉与硝酸纤维素膜摇床平台上温育1 h；ECL发光，暗盒曝光，取出X线片显影、定影。一抗为兔抗人MBP⁃1多克隆抗体，二抗为山羊抗兔辣根过氧化物酶。

1.2.6CCK⁃8法检测细胞生长：取对数生长期骨肉瘤Saos⁃2细胞，按5 000/孔的细胞密度接种于96孔板，每孔含无血清培养液100 μL，实验分组同前，细胞培养24 h后，分别根据前述转染方法转染各组细胞并继续培养，每组分别在24、48、72、96 h检测细胞活性，每个时间点设3个复孔。每孔加入CCK⁃8试剂10 μL，培养箱内反应3 h，在酶标仪波长450 nm处检测吸光度值。根据吸光度值绘制细胞生长曲线。实验重复3次。

1.2.7Western blot检测cyclin D1和cyclin E：取空白对照组、阴性对照组、2个沉默组骨肉瘤细胞，Western blot检测cyclin D1和cyclin E的表达。一抗为兔抗人cyclin D1多克隆抗体和兔抗人cyclin E抗体，二抗为山羊抗兔辣根过氧化物酶。

1.3统计学分析

2　结果

2.1RNA沉默载体鉴定

用pSIREN正义与反义引物对质粒进行PCR扩增、电泳（图1），说明MBP⁃1pSIREN⁃retroQ RNA沉默质粒及阴性对照质粒都已经准确设计与构建。进一步通过U6正义链、pSIREN正义链引物对阴性对照组和2个沉默组质粒进行测序（图2），进一步印证MBP⁃1沉默质粒及阴性对照质粒都已经准确建立。

2.2实时PCR检测MBP⁃1沉默效率

图1　PCR扩增阴性对照质粒和沉默组质粒Fig.1PCR amplification of pSIREN⁃retroQCTE954-N，CTE954-1andCTE954-3

实时PCR检测MBP⁃1mRNA表达，2个沉默组（CTE954⁃1和CTE954⁃3）细胞MBP⁃1mRNA表达显著低于阴性对照组（CTE954⁃N）。沉默组CTE954⁃1表达为0.49±0.035，CTE954⁃3表达为0.45±0.030，说明我们构建的MBP⁃1干扰序列能有效下调骨肉瘤Saos⁃2细胞中MBP⁃1基因在mRNA水平的表达。2.3Western blot检测MBP⁃1沉默效率

为进一步了解设计、建立的MBP⁃1沉默序列能否有效下调骨肉瘤Saos⁃2细胞中MBP⁃1在蛋白水平的表达，取对照组和沉默组细胞，Western blot检测MBP⁃1表达（图3），2个沉默组细胞MBP⁃1蛋白表达水平明显低于阴性对照组，进一步印证了沉默组与对照组序列设计的准确。

2.4CCK⁃8法检测沉默组骨肉瘤Saos⁃2细胞生长

为了解MBP⁃1基因沉默是否对骨肉瘤Saos⁃2细胞生长产生影响，通过CCK⁃8实验（图4）检测对照组和2个沉默组骨肉瘤Saos⁃2细胞增殖。通过测定24、48、72和96 h沉默组和对照组450 nm吸光度值，发现2个沉默组细胞在48、72、96 h吸光度值都显著高于阴性对照组，说明MBP⁃1基因沉默后骨肉瘤Saos⁃2细胞生长即增殖被显著促进。

图2　阴性对照和沉默组测序图Fig.2DNA sequencing of pSIREN⁃retroQCTE954-N，CTE954-1andCTE954-3

图3　Western blot检测MBP-1沉默细胞MBP⁃1表达Fig.3　Expression of MBP⁃1 inMBP-1siRNA Saos⁃2 cell line by Western blot

图4　CCK⁃8法检测MBP-1沉默细胞生长Fig.4　Cell proliferation ofMBP-1siRNA Saos⁃2 cell line by CCK⁃8 assay

2.5Western blot检测沉默组骨肉瘤细胞cyclin D1 和cyclin E表达

为进一步了解MBP⁃1基因沉默对Saos⁃2细胞增殖影响的深层机制，采用Western blot检测正常对照组、阴性对照组和2个沉默组细胞中cyclin D1和cy⁃clin E表达（图5），结果表明cyclin D1和cyclin E在2个沉默组中的表达水平均明显高于阴性对照组。说明MBP⁃1基因下调后影响了骨肉瘤Saos⁃2细胞中与细胞周期调节密切相关的cyclin D1和cyclin E的表达，cyclinD1和cyclinE的表达在沉默组均显著增高。

3　讨论

癌基因c⁃myc编码一种细胞核内的转录因子，在人类许多肿瘤中都被发现有过量表达［5］。在促有丝分裂的刺激下，c⁃myc被快速诱导生成并调节正常的细胞周期［6］，而过度表达c⁃myc会导致细胞中心体数目异常［7］。研究［8］还证实c⁃myc通过诱导DNA损伤和细胞中心体失常，使染色体结构的稳定性损坏。最近的研究［9］证明，c⁃myc在转录水平增强几乎所有被激活基因表达，而不仅仅是对传统认识上的特异靶基因。

图5　Western blot检测MBP-1沉默细胞cyclin D1和cyclin E的表达Fig.5　Expressions of cyclin D1 and cyclin E inMBP-1siRNA Saos⁃2 cell line by Western blot

由于在很多人类肿瘤中都发现癌基因c⁃myc异常过量表达，如胃癌、肝癌还有骨肉瘤，而目前的研究发现许多有关异常肿瘤细胞生物学特性的表现如恶性增殖、侵袭性、转移等都与c⁃myc过度表达直接相关。c⁃myc在许多肿瘤中存在异常表达，其激活的主要方式是扩增和过表达，通过与其下游靶基因结合，影响细胞增殖、生长代谢、基因的不稳定性、刺激血管生成、细胞恶性转化、分化及凋亡等。而MBP⁃1恰好在转录水平抑制c⁃myc表达，因此肿瘤的过度增殖、侵袭和转移等特性就会相应地被抑制。由于MBP⁃1通过抑制c⁃myc过度表达而具有特殊功能，通过其自身表达可以对某些癌基因表达进行抑制，从而在许多肿瘤生物学环节中发挥其特殊的类似抑癌基因的作用［10］。寻找上述对某些癌基因具有控制作用的基因也是目前肿瘤基因治疗靶点寻找的热点，因此以MBP⁃1为靶点基因治疗在肿瘤治疗上具有广阔的前景和应用价值。目前MBP⁃1肿瘤生物学功能研究也证实，作为一种通过抑制癌基因c⁃myc过度表达从而控制肿瘤细胞特异生物学效应的基因，其表达对肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移［11］和凋亡［12］等都有相应作用。而新近在胃癌细胞研究中的例子更是发现c⁃myc和Cox2均在胃癌细胞中过量表达，目前发现它们过表达是由于一种小干扰miRNA⁃363的表达升高引起的［13］，而这种效应的发生是通过抑制MBP⁃1表达来实现；相反，过表达MBP⁃1则使胃癌细胞中c⁃myc和Cox2表达显著下调。

正是基于以上认识，我们通过RNA沉默技术下调骨肉瘤Saos⁃2细胞中MBP⁃1表达，通过PCR扩增及测序证实已经成功构建pSIREN⁃retroQ沉默载体和阴性对照载体。实时PCR及Western blot检测2个沉默组MBP⁃1表达均明显低于对照组，说明MBP⁃1沉默Saos⁃2细胞已成功获取。CCK⁃8法检测MBP⁃1表达下调后骨肉瘤Saos⁃2细胞生长在48～96 h均比对照组显著增高，说明作为一种通过抑制癌基因c⁃myc过度表达从而抑制肿瘤生长、侵袭、转移并促进肿瘤细胞凋亡的蛋白质，其自身的基因表达发挥一种重要的监督作用。为进一步了解这种监督效应的分子生物学机制，本研究采用Western blot检测对照组和2个沉默组中cyclin D1和cyclin E的表达，发现MBP⁃1基因下调后Saos⁃2细胞中cyclin D1和cy⁃clin E表达都显著增高。cyclin D1异常表达和人类肿瘤紧密相关，cyclin D1异常表达会促进肿瘤选择性生长［14］。因此，在很多人类肿瘤中cyclin D1都是肿瘤生长的驱动因素［15］。而异常表达cyclin E也与肿瘤细胞的增殖、转移等呈正相关［16］。以上结果说明，作为通过抑制癌基因c⁃myc过度表达而对肿瘤生物学作用具有监督作用的MBP⁃1，其基因下调很可能在某种程度上导致cyclin D1和cyclin E表达异常，而这种表达的异常升高最终影响到Saos⁃2细胞增殖。

骨肉瘤发生是多基因、多步骤、多阶段、多重损伤并存的过程，我们通过RNA沉默下调骨肉瘤Saos⁃2细胞MBP⁃1的表达，促进了细胞增殖，说明MBP⁃1基因自身表达在控制骨肉瘤细胞增殖中发挥重要的监督作用。进一步研究MBP⁃1对骨肉瘤发生发展的作用机制，将为未来基因治疗寻找骨肉瘤新靶点及其深入研究打下基础。

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（编辑陈姜）

网络出版时间：

中图分类号R738.3

文献标志码A

文章编号0258-4646（2016）07-0604-06

DOI：10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.07.007

基金项目：甘肃省自然科学研究基金计划一般项目（1308RJZA152）

作者简介：施鑫鹤（1973-），男，副主任检验师，硕士. E-mail：shixh@lzu.edu.cn

收稿日期：2015-12-07

Effects of RNA Interfering of MBP⁃1 on Proliferation of Saos⁃2 Cell Line

SHI Xinhe1，GENG Zhe2，SHI Xingchen3，MA Kejun1，ZHU Hongwen1，REN Wen1，ZHOU Yali1
（1.Central laboratory of Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou University，Lanzhou 730030，China；2.Institute of Biochemistry and Molecular Biology，Lan⁃zhou Medical College，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；3.Department of Bone Surgery，The Second People’s Hospital of Lanzhou，Lanzhou 730030，China）

AbstractObjectiveTo investigate the effects of c⁃myc promoter binding protein 1（MBP⁃1）gene on the proliferation of human Saos⁃2 osteo⁃sarcoma cells in vitro.MethodsSaos⁃2 cells were divided into three groups：blank control group（untransfected cells），negative group（cells transfected with missense sequence）and experimental group（cells transfected withMBP⁃1shRNA）.TwoMBP⁃1shRNA sequences and one neg⁃ative control shRNA sequence were designed，synthesized and cloned into pSIREN⁃retroQ plasma.Then the recombinant plasmids were construct⁃ed and transfected into human Saos⁃2 osteosarcoma cells by Lipofectamine 2000.The expressions ofMBP⁃1mRNA and protein in Saos⁃2 cells were detected by real⁃time PCR and Western blot，respectively.The effects of altered expression of MBP⁃1 on cell proliferation were measured by CCK⁃8 cell proliferation assay.The expressions of cyclin D1 and cyclin E in Saos⁃2 were determined by Western blot.ResultsPCR and sequenc⁃ing results indicated that the recombinant plasmids pSIREN⁃retroQ was constructed.The relative expression level ofMBP⁃1mRNA in theMBP⁃1 siRNA transfection group was significantly decreased than that in blank control group（P＜0.05）.Compared with the blank control group，the ex⁃pression levels of MBP⁃1 protein in the experimental group also significantly decreased.The proliferation abilities of Saos⁃2 cells at 48，72，and 96 hours afterMBP⁃1siRNA transfection were significantly increased than those in the blank control group（P＜0.05）.Compared with the blank con⁃trol group，the expression levels of cyclin D1 and cyclin E protein in the experimental group also significantly increased（P＜0.05）.Conclusion Knockdown of the expression ofMBP⁃1gene promotes the proliferation of human Saos⁃2 osteosarcoma cells.MBP⁃1gene may become the new tar⁃get of gene therapy for osteosarcoma.

Keywordsosteosarcoma Saos⁃2 cells；RNA interfering；c⁃myc promoter binding protein 1；cell proliferation