环磷酰胺腹腔注射法及膀胱灌注法制备膀胱过度活动大鼠模型的研究

段乙南，夏志军，许海楠

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）



环磷酰胺腹腔注射法及膀胱灌注法制备膀胱过度活动大鼠模型的研究

段乙南，夏志军，许海楠

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

摘要目的通过环磷酰胺腹腔注射及膀胱灌注2种不同方法制备膀胱过度活动（OAB）大鼠模型，比较2种方法的优缺点。方法随机将30只大鼠分为腹腔注射组、膀胱灌注组和对照组。腹腔注射组及膀胱灌注组分别每3 d腹腔注射或膀胱灌注环磷酰胺（75 mg/kg体质量）1次，共3次，对照组大鼠不予处理。检测3组大鼠最大膀胱容量、最大排尿压（MVP）和逼尿肌不稳定收缩频率，并比较2组大鼠膀胱病理学差异、患病率及死亡率。结果膀胱灌注组与腹腔注射组大鼠最大膀胱容量、最大排尿压及逼尿肌不稳定收缩频率均无统计学差异（P＞0.05）。与对照组比较，膀胱灌注组及腹腔注射组最大膀胱容量明显上升（P＜0.05），最大排尿压明显下降（P＜0.05），逼尿肌不稳定收缩频率显著增高（P＜0.05）。腹腔注射组建模成功率90%，死亡率80%，膀胱灌注组建模成功率50%，死亡率0%。腹腔注射组和膀胱灌注组大鼠膀胱均有病理改变。结论环磷酰胺腹腔注射及膀胱灌注均可致大鼠OAB，可以作为可靠模型，腹腔注射成功率高，但死亡率也高，膀胱灌注成功率低，但死亡率也低。

关键词膀胱过度活动；膀胱灌注；腹腔注射；不同方法

网络出版地址

膀胱过度活动（overactive bladder，OAB）发病率高，且发病率随年龄增长而增高［1-4］。临床上，如下尿路梗阻、膀胱炎、神经源性膀胱及间质性膀胱炎等多种原因均可导致OAB症状。根据造模方法的不同，目前OAB大鼠模型主要有膀胱出口梗阻（bladder outlet obstruction，BOO）模型、断髓模型、细菌性膀胱炎模型和膀胱炎模型等。有研究［5］报道应用腹腔注射环磷酰胺的方法可构建OAB大鼠模型。本研究拟采用腹腔注射及膀胱灌注环磷酰胺的方法制备该模型，并比较这2种方法的优缺点。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物：健康雌性SD大鼠30只，体质量200～250 g，购自北京华阜康生物技术有限公司。建模前检测大鼠尿动力，以确保纳入研究大鼠尿路功能正常。将大鼠随机分为膀胱灌注组、腹腔注射组和对照组，每组各10只。饲养条件为SPF级动物实验室，常规饮食，12 h昼夜节律，湿度50%～60%，温度25～27℃。

1.1.2主要试剂：环磷酰胺购自美国Sigma公司。

1.2实验方法

1.2.1实验动物分组：（1）腹腔注射组，腹腔注射环磷酰胺75 mg/kg，每3 d注射1次，共注射3次。第10天在戊巴比妥钠麻醉下检测尿动力（排尿间隔时间、基础膀胱压、膀胱最大充盈压、最大排尿压），连续测定3个排尿周期。膀胱充盈期逼尿肌不稳定收缩幅度＞5 mmHg则认为OAB造模成功［6］。（2）膀胱灌注组，膀胱灌注环磷酰胺75 mg/kg，每3 d灌注1次，共灌注3次。第10天在戊巴比妥钠麻醉下测尿动力，未成功者继续给予膀胱灌注建模。（3）对照组，不予处置，第10天在戊巴比妥钠麻醉下测尿动力。1.2.2标本采集：待尿动力检测完成后脱臼处死大鼠，完整切除膀胱，肉眼观察膀胱大体变化，石蜡包埋切片，HE染色，显微镜下观察膀胱黏膜细胞形态变化。

1.3统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料用±s表示，采用t检验比较组间差异，计数资料采用精确概率法进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1尿动力学改变

对照组正常大鼠膀胱充盈期呈低压状态，排尿期膀胱压明显升高，随排尿活动，建模成功后大鼠膀胱在充盈期出现逼尿肌不稳定收缩，形成锯齿形图案，见图1；最大膀胱容量和逼尿肌不稳定收缩频率明显升高，最大排尿压明显降低，最大膀胱容量、逼尿肌不稳定收缩频率及最大排尿压在建模前后的差值与对照组比较有统计学差异（P＜0.05），见表1。

表1　尿动力改变Tab.1　Change of urodynamics

2.2病理改变

膀胱灌注组及腹腔注射组膀胱黏膜可见上皮充血、炎性细胞浸润，上皮细胞肥大，膀胱壁增厚，肌细胞肥大，逼尿肌内胶原含量明显增多。而对照组大鼠膀胱黏膜上皮由2～3层移行细胞组成，细胞扁平，大小一致。见图2。

2.3OAB大鼠建模成功率和死亡率

结果显示，腹腔注射组建模成功率（90%）高于膀胱灌注组（50%），差异有统计学意义（P＜0.01）；腹腔注射组死亡率（80%）高于膀胱灌注组（0%），差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4大鼠状态改变

腹腔注射组大鼠有不同程度的全身症状，如精神萎靡，眼角及鼻孔有渗血，进食量逐渐减少，可见肉眼血尿，大便逐渐呈稀糊状，体质量下降，建模后成活率低；而膀胱灌注组大鼠精神状态佳，活力接近正常大鼠，体质量无明显下降。

图1　各组大鼠尿动力学检测结果Fig.1　Urodynamic results of each group

图2　各组大鼠膀胱病理改变Fig.2　Pathologic changes of the bladders

3　讨论

OAB综合征是一种以尿急症状为特征的症候群，常伴有尿频和夜尿，也可伴有或不伴急迫性尿失禁症状［7］。在尿动力学上，OAB可特征性地表现为膀胱充盈期出现无意识的逼尿肌自发或诱发的收缩，即逼尿肌过度活动，也可表现为其他形式的尿道-膀胱功能障碍［8］。

环磷酰胺所致大鼠OAB接近人类［6］，是目前常用的构建OAB模型的方法。但既往建模时多使用腹腔注射的方法，本研究采用膀胱灌注环磷酰胺的方法构建OAB模型，并比较了2种方法建模的特点。

尿动力学检查可客观反映下尿路功能状态，是临床诊断排尿功能障碍的重要手段［9］。本研究中，尿动力学检查结果显示，与对照组比较，腹腔注射组及膀胱灌注组大鼠均有膀胱最大容量升高、最大排尿压降低以及逼尿肌不稳定收缩频率升高，差异有统计学意义（P＜0.05），但这2组大鼠尿动力结果无统计学差异，均为建模成功大鼠。

腹腔注射与膀胱灌注是药物作用于整体与局部的差别，2种方法所建OAB模型各有优缺点。腹腔灌注方法操作简单，只需每3 d腹腔注射环磷酰胺1次，建模成功率高，3次给药后建模成功率为90%，但大鼠状态较差，建模后5 d死亡率可达80%，与环磷酰胺对大鼠的全身毒性有关。腹腔注射经腹膜吸收，其代谢产物作用于膀胱及全身各器官，产生膀胱过度刺激，同时对其他器官也产生损害。自腹腔注射给药第8天开始，大鼠精神状态渐差，逐渐萎靡，呈弓背状态，进食减少。腹腔灌注方法所建OAB模型不适于长期活体研究，但膀胱黏膜充血、细胞增大、肌层胶原增多、肌细胞肥大等病理改变明显，可用于病理及病因学等方面的短期或离体研究。

目前对膀胱功能的的研究大部分来自体外实验，如使用大鼠膀胱逼尿肌的肌肉条［10］。膀胱灌注法建模过程略复杂，麻醉后对大鼠行环磷酰胺膀胱灌注，麻醉期间环磷酰胺能够直接作用于膀胱组织，可使药物在膀胱滞留以维持药物浓度，对其他器官的影响少，但由于麻醉2～3 h后大鼠清醒自主排尿，排出大部分药物，导致建模成功率较低（约50%），对建模未成功大鼠可继续给药直至建模成功。膀胱灌注组大鼠尿动力同腹腔灌注组，而病理改变较腹腔注射稍轻。可能由于膀胱是修复能力很强的器官，停止膀胱给药后，约10 d左右膀胱通过自我修复使尿动力逐渐恢复至接近正常，病理改变也较前减轻，因此，需持续给药以维持OAB症状。虽然膀胱灌注法操作略复杂，但大鼠存活率高，精神状态及活力佳，无全身毒性症状，有助于建模后OAB症状的长期观察及后期治疗等在体研究。

综上所述，环磷酰胺膀胱灌注法与腹腔注射法均能建立可靠的OAB动物模型，2种环磷酰胺给药方法建模各有优缺点，宜根据特定需要选择相应的方法。

参考文献：

［1］BARTOLI S，AGUZZI G，TARRICONE R.Impact on quality of life of urinary incontinence and overactive bladder a systematic litera⁃ture review［J］.Urology，2010，75（3）：491-500.

［2］STEWART WF，VAN ROOYEN JB，CUNDIFF GW，et al.Preva⁃lence and burden of overactive bladder in the United States［J］. World J Urol，2003，20（6）：327-336.

［3］IRWIN DE，MILSOM I，HUNSKAAR S，et al.Population⁃based sur⁃vey of urinary incontinence，overactive bladder，and other lower uri⁃nary tract symptoms in five countries results of the EPIC study［J］. Eur Urol，2006，50（6）：1306-1315.

［4］WENNBERG AL，MOLANDER U，FALL M，et al.A longitudinal population⁃based survey of urinary incontinence，overactive blad⁃der，and other lower urinary tract symptoms in women［J］.Eur Urol，2009，55（4）：783-791.

［5］KIM SE，SHIN MS，KIM CJ，et al.Effects of tamsulosin on urinary bladder function and neuronal activity in the voiding centers of rats with cyclophosphamideinduced overactive bladder［J］.Int Neurou⁃rol J，2012，16（1）：13-22.

［6］PAN F，LIU D，HAN XM，et al.Urodynamic investigation of cyclo⁃phosphamiade⁃induced overactive bladder in conscious rats［J］. Chin Med J（Eng），2012，125（2）：321-325.

［7］LEONE ROBERTI MAGGIORE U，SALVATORE S，ALESSANDRI F，et al.Pharmacokinetics and toxicity of antimuscarinic drugs for overactive bladder treatment in females［J］.Expert Opin Drug Metab Toxicol，2012，8（11）：1387-1408.

［8］ROBINSON D，CARDOZO L.Overactive bladder：diagnosis and management［J］.Maturitas，2012，71（2）：188-193.

［9］WRIGHT A.Exploring the evidence for using TENS to relieve pain ［J］.Nurs Times，2012，108（11）：20-23.

［10］GOLDSTEIN RE，WESTROPP JL.Urodynamic testing in the diag⁃nosis of small animal micturition disorders［J］.Clin Tech Small Anim Pract，2005，20（1）：65-72.

（编辑王又冬）

网络出版时间：

中图分类号R334.3

文献标志码B

文章编号0258-4646（2016）07-0587-04

DOI：10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.07.003

基金项目：国家科技部十二五“重大新药创制”科技重大专项课题（2012ZX09401004）；辽宁省自然科学基金（20102255）；辽宁省科学技术计划（2012225017）

作者简介：段乙南（1989-），女，硕士研究生.

通信作者：夏志军，E-mail：xiazj@sj⁃hospital.org

收稿日期：2015-11-12

ConstructionofExperimentalAnimalModelofOveractiveBladderinRatInducedbyCyclophosphamide IntraperitonealInjectionandIntravesicalInstillation

DUANYinan，XIAZhijun，XUHainan
（DepartmentofGynecologyandPelvicFloorDisease，ShengjingHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110004，China）

AbstractObjectiveTo compare the advantages and disadvantages of two methods for rat overactive bladder（OAB）model construction in⁃duced by intraperitoneal injection and intravesical instillation cyclophosphamide.MethodsA total of 30 female SD rats weighting 200⁃250 g were randomlycategorized intothreegroups：intraperitoneal injection⁃induced OAB（Ip⁃OAB），intravesical instillation⁃induced group（Iv⁃OAB）andcon⁃trolgroup.Ip⁃OABratswasi.p.administrated cycbophosphe midethreetimesindoseof75mg/kgbodyweight，whileIv⁃OABratsreceived intravesi⁃cal instillation three timesin drugdose of 75mg/kg bodyweight.Control group rats received notreatment.Maximum bladder capacity（MBC），maxi⁃mum voiding pressure（MVP），frequency of spontaneous contraction of each group were recorded.The incidence，the mortality and the pathology of the three groups were compared.ResultsMBC，MVP and frequency of spontaneous contraction between Ip⁃OAB group and Iv⁃OAB group had no statisticallysignificantdifference（P＞0.05）.Comparedwiththecontrolgroup，MBCsignificantlyincreased（P＜0.05），MVPsignificantlydecreased （P＜0.05），and frequency of spontaneous contraction significantly increased（P＜0.05）in Ip⁃OAB and Iv⁃OAB rats.The modeling success rate and mortality were 100%and 80%in Ip⁃OAB group，and were 50%and 0%in Iv⁃OAB group，and pathological changes were found in the two groups. ConclusionThe construction of experimental animal model of OAB in rat induced by intraperitoneal injection and intravesical instillation cyclo⁃phosphamide are both reliable methods.Ip⁃OAB rats exhibit high incidence and mortality rate，while Iv⁃OAB rats show low incidence and mortality rate.

Keywordsoveractive bladder；intraperitoneal injection；intravesical instillation；different methods