SAHA和TRAIL联合使用对三阴性乳腺癌细胞MDA⁃MB⁃231生长状态的影响

韩翰，徐佳

（沈阳医学院基础医学院1.生物化学教研室；2.病原生物学教研室，沈阳 110034）



SAHA和TRAIL联合使用对三阴性乳腺癌细胞MDA⁃MB⁃231生长状态的影响

韩翰1，徐佳2

（沈阳医学院基础医学院1.生物化学教研室；2.病原生物学教研室，沈阳 110034）

摘要目的实时观测辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）联合使用对三阴性乳腺癌细胞MDA⁃MB⁃231生长状态的影响。方法应用实时无标记细胞分析系统（RTCA）动态监测SAHA和TRAIL联合使用对乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞生长状况的影响，并通过BiostationIM活细胞工作站收集各种处理因素对MDA⁃MB⁃231细胞增殖干扰作用的形态学证据。结果xCELLigence RTCA显示SAHA和TRAIL具有协同抑制MDA⁃MB⁃231细胞生长的作用，其中50 ng/mL TRAIL与5 μmol/L SAHA联合作用效果最佳。活细胞工作站显示SAHA和TRAIL联合处理对MDA⁃MB⁃231细胞生长的抑制效果较SAHA或TRAIL单独处理更显著。结论SAHA和TRAIL联合使用对三阴性乳腺癌细胞MDA⁃MB⁃231的生长具有协同抑制作用。

关键词辛二酰苯胺异羟肟酸；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；三阴性乳腺癌细胞

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乳腺癌是严重影响女性健康的最常见恶性肿瘤之一［1⁃2］。在临床上，将雌激素受体（estrogen re⁃ceptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）及人表皮生长因子受体（human epidermal growth fac⁃tor receptor⁃2，HER⁃2）均不表达的乳腺癌称为三阴性乳腺癌。它以恶性程度高、侵袭性强及预后差为主要特征，是目前乳腺癌治疗的难点之一［3⁃4］。由于不表达ER及HER⁃2，三阴性乳腺癌不能从内分泌治疗和抗HER⁃2的靶向治疗中获益，因此，寻找新的治疗靶点成为三阴性乳腺癌研究的热点［5］。

研究［6⁃7］显示，组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸（su⁃beroylanilide hydroxamic acid，SAHA）可通过抑制HDAC活性，诱导靶细胞中组蛋白高度乙酰化，启动某些特异性基因的表达，而达到阻断肿瘤生长的目的。有文献［8］指出，SAHA可诱导MCF⁃7、MDA⁃MB⁃231、MDA⁃MB⁃435、SKBr⁃3等乳腺癌细胞的凋亡。但近年来的研究证明，SAHA浓度过高时对细胞具有较大的毒副作用。另外，SAHA在体内的半衰期短、易代谢，长期使用会产生不同程度的耐药性。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF⁃related apop⁃tosis inducing ligand，TRAIL）是1995年WILEY等［9］发现的一种凋亡分子，为Ⅱ型膜蛋白，属于肿瘤坏死因子（tumor necrosis factors，TNF）家族，能够诱导多种肿瘤细胞与转化细胞发生凋亡，可特异性地抑制肿瘤细胞的生长，对正常细胞无毒性作用，具有良好的临床应用价值。本研究拟实时观测SAHA和TRAIL联合使用对三阴性乳腺癌细胞MDA⁃MB⁃231细胞生长状态的影响，以期为三阴性乳腺癌的临床治疗提供有价值的候选方案。

1　材料与方法

1.1材料

人乳腺癌细胞株MDA⁃MB⁃231购自美国ATCC细胞库；Leibovitz’s L⁃15培养基、胎牛血清、青霉素及链霉素均购自美国Thermo公司；SAHA购自美国Sigma⁃Aldrich公司；人重组TRAIL蛋白购自美国Pe⁃protech公司；CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay试剂盒购自美国Promega公司；Annexin⁃V⁃FLUOS staining kit购自美国Roche公司；其他化学试剂购自美国Sigma⁃Aldrich公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养：将人乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞培养于含15%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素的Leibovitz’s L⁃15培养基中。

1.2.2实时细胞增殖检测：将乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞（1×104/mL）接种于xCELLigence实时无标记动态细胞分析系统的E⁃Plate 96孔板（Roche公司）中，细胞无血清同步化处理后，各孔分别加入不同浓度的SAHA（0，0.5，1，2，5，10，20，50 μmol/L）以及TRAIL（0，5，10，20，30，40，50，100 ng/mL）进行孵育，以DMSO为对照组。通过xCELLigence系统每孔中细胞指数（cell index，CI）的动态变化了解0～72 h 内MDA⁃MB⁃231细胞的生长状况，实验重复3次。

1.2.3RTCA实时分析系统检测结果的验证：同时利用CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Prolifera⁃ tion Assay试剂盒验证实时细胞增殖检测结果。将1×104/mL MDA⁃MB⁃231细胞接种于96孔板各孔中，细胞无血清同步化处理24 h后，按1.2.2方法加入不同浓度的SAHA和TRAIL共同孵育。MDA⁃MB⁃231细胞分别培养24、48 h后进行MTT测定，了解细胞增殖的情况。

1.2.4实时活细胞成像：将乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞（5×105/mL）接种于BioStationIM活细胞工作站μ⁃Slide 4 Well（Nikon公司）各孔中，待细胞无血清同步化处理后，加入SAHA和TRAIL共同孵育48 h。设定BioStationIM活细胞工作站以相差模式、总拍摄时长48 h、间隔12 h示踪μ⁃Slide各孔中MDA⁃MB⁃231细胞的生长状况，实时收集各处理因素对细胞增殖干扰的形态学证据。

1.2.5细胞凋亡荧光检测：将MDA⁃MB⁃231细胞（5× 105/mL）接种于12孔板中，同步化处理后，加入SAHA和TRAIL与MDA⁃MB⁃231细胞分别孵育0、4、12、24、36、48 h。向孵育后的细胞分别加入100 μL Annexin⁃V⁃FLUOS荧光染液，室温静置15 min后，应用Leica DMI6000B显微镜进行荧光观察。

1.3统计学分析

采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析，计量资料以±s表示。采用单因素方差分析比较多组数据，采用t检验对比分析对照组与各实验组之间的差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1SAHA和TRAIL对乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞增殖的影响

通过xCELLigence RTCA分析系统实时观测0～50 μmol/L SAHA对MDA⁃MB⁃231细胞生长状态的影响，结果如图1A所示：未行SAHA处理的细胞，随着时间的推移，其CI持续增加，48 h到达生长平台期，说明MDA⁃MB⁃231细胞生长状况良好；而经不同浓度SAHA作用的MDA⁃MB⁃231细胞，随着处理时间的延长、SAHA浓度的增加，CI值逐渐下降，细胞生长被抑制。其中，高浓度SAHA（20～50 μmol/L）作用24 h即可表现出明显的抑制效果，作用48 h后，细胞已基本死亡。而低浓度实验组（0.5～2.0μmol/L）细胞曲线维持稳定，细胞生长状况未受明显影响，SAHA作用效果不明显。当SAHA浓度达到5.0 μmol/L时，随着作用时间的延长，细胞效应曲线持续下降，细胞生长被抑制，当作用时间达到48 h时，CI曲线下降幅度与对照组相比，差异具有统计学意义，SAHA的抑制作用达到最佳。而作为对照的DMSO对MDA⁃MB⁃231细胞增殖作用的影响如图1B所示：加入不同浓度的DMSO后，MDA⁃MB⁃231细胞生长状况基本良好，CI持续增加，DMSO未表现出明显的细胞毒性作用。

图1　xCELLigence RTCA分析系统实时观测SAHA和DMSO对乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞增殖的影响Fig.1　Real⁃time cell proliferation assays on the effects of SAHA and DMSO on proliferation of breast cancer cells MDA⁃MB⁃231

将不同浓度TRAIL（0～100 ng/mL）与MDA⁃MB⁃231细胞共同培养于xCELLigence RTCA系统中，结果显示TRAIL对MDA⁃MB⁃231细胞的抑制效果显著（图2 A）。

图2　xCELLigence RTCA分析系统实时观测SAHA联合TRAIL对乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞增殖的影响Fig.2　Real⁃time cell proliferation assays of the effects of combined treatment with TRAIL and SAHA on proliferation of breast cancer cells MDA⁃MB⁃231

2.2SAHA和TRAIL联合作用对乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞增殖的影响

以0～100 ng/mL TRAIL和5 μmol/L SAHA联合作用于MDA⁃MB⁃231细胞，结果显示细胞增殖受到明显抑制，较TRAIL单独作用时效果更显著，具有联合效应。如图2B所示：5 μmol/L SAHA与不同浓度TRAIL联合作用细胞24 h后，CI曲线趋于水平并开始下行，说明MDA⁃MB⁃231细胞生长已受到抑制，细胞增殖处于停滞状态，而随着SAHA和TRAIL联合作用时间的延长，CI曲线下降明显。其中，TRAIL浓度为50 ng/mL、作用时间为48 h时联合作用效果最强，且该结果由MTT检测进一步得到确认（图2C、2D）。

2.3TRAIL和SAHA联合作用对乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞形态的影响

应用BioStationIM活细胞工作站观察SAHA和TRAIL对乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞生长状况的影响，结果如图3、4所示：随着时间的推移，DMSO对照组在处理48 h后细胞形态正常，生长状况良好，铺满率达90%；而SAHA、TRAIL单独处理后的乳腺癌细胞呈现不同的形态学改变，SAHA处理MDA⁃MB⁃231细胞12 h后，细胞出现明显的凋亡改变，细胞变圆、固缩、破碎，体积减小，凋亡荧光检测发现大量荧光染色的凋亡细胞，而TRAIL处理的细胞在24 h时才呈现出较明显的凋亡形态学变化。SAHA和TRAIL联合作用对MDA⁃MB⁃231细胞形态改变的协同效果明显，接种细胞在不同时间点的贴壁生长均受到影响，处理12 h后即出现大量圆形破碎细胞，24 h后超过50%的细胞已经凋亡，荧光显微镜下呈现大量片状荧光染色的凋亡细胞。

图3　显微镜下观察SAHA联合TRAIL对乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞形态的影响Fig.3　Microscopic observation of the effects of combination treatment of TRAIL and SAHA on morphology of breast cancer cells MDA⁃MB⁃231

3　讨论

乳腺癌是一种具有高度异质性的肿瘤，包括病理特征与疾病预后各不相同的5种分子亚型［10⁃12］。其中，三阴性乳腺癌占所有乳腺癌的10%～15%。因其ER、HER⁃2受体表达均为阴性，现有的内分泌治疗和HER⁃2靶向治疗都不适用于三阴性乳腺癌，寻找新的治疗靶点成为三阴性乳腺癌研究的重要挑战。

图4　荧光检测SAHA联合TRAIL对乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞形态的影响Fig.4　The fluorescent detection of the effects of combined treatment of TRAIL and SAHA on morphology of breast cancer cells MDA⁃MB⁃231

HDACs的异常表达和活化存在于许多人类疾病中，尤其是肿瘤和炎症相关的疾病。研究［13］表明，乳腺细胞功能异常时HDACs的活性明显增强，组蛋白处于低乙酰化状态，基因表达平衡状态被破坏，某些调控细胞增殖、分化和凋亡的基因表达失衡，导致乳腺癌的形成。

近年来，大量研究证实SAHA可结合HDACs的催化位点，通过抑制HDACs活性促进乙酰化组蛋白增加，造成癌细胞转录过程异常，诱导癌细胞分化，阻滞癌细胞周期进程，促进癌细胞凋亡的发生。本研究结果显示，随着处理时间的延长及SAHA浓度的增加，三阴性乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞CI曲线下降，细胞生长受到抑制。其中，高浓度SAHA（20～50 μmol/L）作用MDA⁃MB⁃231细胞24 h即可显现较明显的抑制效果，说明高浓度SAHA具有显著的抗肿瘤效应。但也有研究显示浓度过高的SAHA对正常细胞具有较大的毒性作用。同时，SAHA在体内的半衰期短、易代谢，长期使用会产生不同程度的耐药。而以SAHA为基础的联合用药一方面可降低单药用药剂量、保护人体正常细胞，另一方面，还可有效地协同杀伤肿瘤细胞，因此，寻找合适的配伍方案成为新的研究热点［14⁃16］。

TRAIL能够诱导多种肿瘤细胞与转化细胞发生凋亡，而对正常细胞无毒性作用，具有良好的临床应用价值。因此，本研究将SAHA与TRAIL联合作用于乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞，研究其对乳腺癌细胞生长的联合作用。MDA⁃MB⁃231是TRAIL敏感细胞系，xCELLigence RTCA结果显示TRAIL对MDA⁃MB⁃231的抑制效果明显。0～100 ng/mL TRAIL和5 μmol/L SAHA联合作用于MDA⁃MB⁃231细胞，协同抑制效果显著。其中，TRAIL浓度为50 ng/mL、作用时间为48 h时，协同抑制效果最强。形态学研究结果显示，SAHA和TRAIL联合作用MDA⁃MB⁃231细胞12 h后，可见大量圆形破碎细胞，24 h时超过50%的细胞已经凋亡。

综上所述，本研究结果显示，SAHA和TRAIL联合应用对三阴性乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞的生长具有协同抑制作用，这2种药物的联合使用具有良好的临床应用前景。

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（编辑王又冬）

网络出版时间：

中图分类号R329.24

文献标志码A

文章编号0258-4646（2016）07-0591-06

DOI：10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.07.004

基金项目：国家自然科学基金（81172509）；辽宁省教育厅科学研究一般项目（L2013404）

作者简介：韩翰（1982-），女，讲师，博士研究生.

通信作者：徐佳，E-mail：toxujia@163.com

收稿日期：2015-11-12

Effects of Combination of SAHA and TRAIL on Proliferation of Triple⁃negative Breast Cancer Cell MDA⁃MB⁃231

HAN Han1，XU Jia2
（1.Department of Biochemistry，College of Basic Medical Science，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Department of Pathogenic Biology，Col⁃lege of Basic Medical Science，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China）

AbstractObjectiveTo investigate the effects of combined treatment of suberoylanilide hydroxamic acid（SAHA）and TNF⁃related apoptosis inducing ligand（TRAIL）on proliferation and morphology change of triple⁃negative breast cancer cell MDA⁃MB⁃231.MethodsThe effects of combination treatment of SAHA and TRAIL on proliferation and morphology change of MDA⁃MB⁃231 cells were monitored by RTCA.Morphology changes of MDA⁃MB⁃231 cells by different treatment factors were observed through time⁃lapse live cell imaging acquisition.ResultsReal⁃time cell proliferation assays showed that a synergistic effect were found when MDA⁃MB⁃231 cells were treated with combination of SAHA and TRAIL，and reached the best effect with 5 μmol/L SAHA and 50 ng/mL TRAIL.The results of time⁃lapse live cell imaging acquisition showed that the growth inhibition of MDA⁃MB⁃231 cells with combined treatment of SAHA and TRAIL were more obvious than that with treatment of SAHA or TRAIL alone.ConclusionThe combined treatment of SAHA and TRAIL induces a synergistic effect on growth inhibition in triple⁃negative breast cancer cell line MDA⁃MB⁃231.

Keywordssuberoylanilide hydroxamic acid；TNF⁃related apoptosis inducing ligand；triple⁃negative breast cancer cell