胰腺癌MiaPaCa-2细胞与树突细胞融合诱导肿瘤抗原特异性细胞毒T淋巴细胞能力的体外研究

杨金光　陈江　李宏宇　郭晓钟



·论著·

胰腺癌MiaPaCa-2细胞与树突细胞融合诱导肿瘤抗原特异性细胞毒T淋巴细胞能力的体外研究

杨金光陈江李宏宇郭晓钟

067000河北承德，承德市第三医院药剂科(杨金光)；中国人民解放军沈阳军区总医院消化科(杨金光、陈江、李宏宇、郭晓钟)

【摘要】目的建立胰腺癌MiaPaCa-2细胞与树突细胞(DC)融合的细胞，观察其体外诱导胰腺癌肿瘤抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的能力。方法自胰腺癌患者外周血单核细胞中分离和培养DC，利用50% PEG-10% DMSO融合剂将MiaPaCa-2细胞融合到DC，以不加融合剂仅将DC与MiaPaCa-2共培养组及单纯DC组作为对照。采用FITC-CD86及PE-MUC1进行双标记，上流式细胞仪检测细胞融合率；MTT法检测各组DC存活率。按照DC与T淋巴细胞1∶10、1∶20、1∶40、1∶80的比例混合培养细胞，评价各组DC体外刺激自体T淋巴细胞的增殖能力；ELISA法检测各组DC体外激发的CTL的IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-γ分泌量。结果DC与MiaPaCa-2融合细胞组的融合率为(42.30±7.30)%，明显高于共培养组的(7.21±1.06)%。DC组、共培养组、融合细胞组DC的存活率分别为95.0%以上、85.0%、62.8%，融合细胞组DC存活率显著低于DC组及共培养组，差异有统计学意义(P值均<0.05)。DC∶T淋巴细胞为1∶10时，DC组、共培养组、融合细胞组DC刺激自体T细胞增殖指数分别为219±42、3 584±317、8 201±424，1∶20时分别为110±14、2 179±104、6 152±104，融合细胞组显著高于DC组及共培养组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；为1∶40、1∶80 时3组细胞的T细胞增殖指数差异无统计学意义(P值均>0.05)。DC∶T淋巴细胞为1∶10时，DC组、共培养组、融合细胞组DC激发的CTL的IL-2分泌量分别为(27.30±5.21)、(897.44±93.05)、(2243.80±381.46)ng/L；IL-10分泌量分别为(19.55±2.05)、(424.60±108.25)、(706.53±161.29)ng/L；Granzyme B分泌量为(16.23±1.23)、(451.07±120.50)、(1327.77±205.15)ng/L；IFN-γ分泌量为(30.11±4.32)、(982.00±124.68)、(2421.04±488.50)ng/L。融合细胞组激发的CTL的细胞因子分泌量显著高于DC组及共培养组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。结论DC与MiaPaCa-2融合的细胞具备体外诱导胰腺癌肿瘤抗原特异性CTL的能力。

【关键词】胰腺肿瘤；树突细胞；细胞融合；T淋巴细胞，细胞毒性

Fund program：National Natural Science Foundation of China(81071982)

胰腺癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，多数病例在发现时已属晚期，手术治疗及放、化疗作用有限，患者预后极差，临床迫切需要探索新的有效治疗手段[1-2]。树突细胞(dendritic cell, DC)肿瘤疫苗可主动免疫抗肿瘤，已成为肿瘤免疫治疗的研究热点之一[3]。本研究将人胰腺癌MiaPaCa-2细胞与DC相融合，观察其体外诱导肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)的能力，为今后DC-胰腺癌肿瘤细胞融合疫苗的构建开发奠定前期实验基础。

材料与方法

一、材料及试剂

筛选2013年4月至2015年3月期间沈阳军区总医院消化科收治的6例HLA-A2+晚期胰腺癌患者，其中男性3例，女性3例，年龄39～70岁，平均55岁。所有患者均经组织病理学检查(剖腹探查活检5例，细针穿刺活检1例)证实为胰腺癌。入选前未经放、化疗及免疫治疗。所有患者均签署知情同意书，并经医院伦理委员会批准，批准号为201200165。

RPMI 1640、小牛血清购自Hyclone公司，rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α购自PeproTec公司，鼠抗人CD40、HLA-DR、CD83和CD86单抗购自Santa-Cruz公司，兔抗人MUC1多抗购自DPC-Biermann公司，Trizol、 MTT、50% PEG-10% DMSO、Ficoll淋巴细胞分离液购自Sigma公司，3H标记甲基胸腺嘧啶由中科院原子能所提供，IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-γ细胞因子检测试剂盒购自BD公司。

二、DC分离、培养和鉴定

参照文献[4]方法，通过Ficoll密度梯度离心法分离来自胰腺癌患者100 ml外周血中的单核细胞，培养1 h后，取出未贴壁的细胞另行培养备用，贴壁细胞继续培养20 h，更换新鲜培养液后加入rhGM-CSF(800 IU/ml)和rhIL-4(500 IU/ml)，37℃、5% CO2培养箱中继续培养5 d，加入TNF-α (10 ng/ml)培养至7 d，收集成熟DC。使用倒置显微镜和电镜连续观察体外培养5～10 d DC的形态学变化。用流式细胞仪分析DC的特征性标志CD40、CD83、CD86以及MHC类分子HLA-DR等的表达水平。

三、胰腺癌MiaPaCa-2细胞系与DC融合

因人胰腺癌细胞株MiaPaCa-2(沈阳军区总医院消化科实验室保存)连续传代培养20代后仍稳定表达MUC1蛋白[5]，故选择MiaPaCa-2细胞进行融合。MiaPaCa-2细胞接种于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，置37℃、5% CO2的培养箱中培养。取对数生长期细胞，用25 μg/ml丝裂霉素处理30 min去增殖后，与培养5 d的DC以3∶1混合，离心尽量吸尽上清，置37℃水浴，滴加预热的50% PEG-10% DM融合剂0.8 ml，作用2 min后加入1 ml血清终止反应。设不加融合剂的MiaPaCa-2与DC共培养组及单纯DC组作为对照。细胞分别培养24、48、72、96 h，严格按说明书操作。收集各组培养细胞，采用FITC-CD86及PE-MUC1进行双标记，按说明书操作。上流式细胞仪检测细胞融合率，融合率(%)=(融合组双标率-共培养组双标率)×100%。同时使用MTT法检测各组DC的存活率。

四、MiaPaCa-2与DC融合细胞体外刺激自体T淋巴细胞增殖

分别收集DC组、共培养组、融合细胞组的DC，调节细胞浓度为1×105/ml作为刺激细胞，取上述患者自体外周血单核细胞培养1 h的悬浮T淋巴细胞，调节细胞浓度为1×106/ml作为反应细胞，按照刺激与效应细胞1∶10、1∶20、1∶40、1∶80比例加入到96孔板中，终体积200 μl，以RPMI-1640培养液替代效应细胞作为对照组，每组设4个复孔，置37℃、5% CO2培养箱中培养5 d，在收获细胞前18 h加入3H-TdR，每孔1μCi。使用液闪烁仪检测各孔每分钟脉冲数(CPM)。

五、MiaPaCa-2与DC融合细胞体外激发抗原特异性CTL释放细胞因子

分别以3组中的DC为刺激细胞，以患者自体T淋巴细胞为效应细胞，两种细胞按1∶10比例混合反应14 d，应用ELISA法检测细胞培养上清中IL-2、IL-10、Granzyme B和IFN-γ含量，按试剂盒说明书操作。细胞培养上清用试剂盒中样本稀释液稀释50倍，每个样本设2个复孔，取平均值。

六、统计学处理

结果

一、DC的分离、培养和鉴定

经体外分离、培养，DC数量达初始数量的10～15倍。镜下见胞体向四周伸出大量树枝状或裙褶状不规则突起，部分突起末端呈球状膨大(图1)。未成熟DC的表面标志物CD40、HLA-DR、CD83、CD86阳性细胞数分别为总细胞数的9.12%、11.05%、29.84%、11.50%；成熟DC分别为35.20%、49.07%、74.02%、86.73%，成熟DC表面标志物的表达均显著高于未成熟DC，差异有统计学意义(t值分别为6.50、2.94、2.09、4.51，P值均<0.05)。

图1　胰腺癌患者外周血培养5 d(1A)及7 d(1B)的DC形态改变(1A.吉姆萨染色　×200；1B.透射电镜　4 μm)

二、DC与MiaPaCa-2融合细胞的鉴定及融合率

经50%PEG-10% DMSO融合剂诱导融合后，部分DC与MiaPaCa-2细胞先发生细胞膜融合，形成双核的巨大细胞，而后细胞核逐渐发生融合，形成DC与MiaPaCa-2的融合细胞(DC-MiaPaCa-2)。

MiaPaCa-2为MUC1阳性细胞，不表达CD86抗原；而DC为CD86阳性细胞，不表达或低表达MUC1抗原。经FITC-CD86及PE-MUC1双标记，融合细胞组CD86及MUC1双阳性的DC为(42.30±7.30)%，共培养组为(7.21±1.06)%，DC-MiaPaCa-2融合率为(35.09±6.24)%(图2)。

三、DC组、共培养组、融合细胞组的DC存活率

DC组中DC的存活率在95.0%以上；共培养组中DC存活率稳定在85.0%左右；融合细胞组中DC存活率呈时间依赖性显著下降，最低至62.8%(图3)。融合细胞组DC存活率显著低于共培养组，差异有统计学意义(t=8.78，P<0.05)。

四、DC组、共培养组、融合细胞组DC体外刺激自体T淋巴细胞的增殖

DC∶T淋巴细胞为1∶10时，DC组、共培养组、融合细胞组DC刺激自体T细胞增殖指数分别为219±42、3 584±317、8 201±424；为1∶20时，3组的T细胞增殖指数分别为110±14、2 179±104、6 152±104。融合细胞组的T细胞增殖指数显著高于共培养组，差异均有统计学意义(t值分别为12.55、10.39，P值均<0.05)。而DC∶T淋巴细胞为1∶40、1∶80 时，3组细胞的T细胞增殖指数差异无统计学意义(P值均>0.05)。

五、DC组、共培养组、融合细胞组DC体外激发抗原特异性CTL的细胞因子分泌量

DC∶T淋巴细胞为1∶10时，DC组、共培养组、融合细胞组DC激发的CTL的IL-2分泌量分别为(27.30±5.21)、(897.44±93.05)、(2243.80±381.46)ng/L；IL-10分泌量分别为(19.55±2.05)、(424.60±108.25)、(706.53±161.29)ng/L；Granzyme B分泌量为(16.23±1.23)、(451.07±120.50)、(1327.77±205.15)ng/L；IFN-γ分泌量为(30.11±4.32)、(982.00±124.68)、(2421.04±488.50)ng/L。融合细胞组DC激发的CTL的细胞因子分泌量显著高于共培养组，差异均有统计学意义(t值分别为15.20、8.78、10.67、20.31，P值均<0.05)。

图2　MiaPaCa-2细胞(2A)、DC(2B)、DC-MiaPaCa-2(2C)的CD86、MUC1表达

图3　DC组、共培养组、融合细胞组DC存活率

讨论

DC肿瘤疫苗的实质是以特异性T细胞为基础的细胞免疫，有关胰腺癌DC疫苗构建在于选取适合的肿瘤相关抗原和采用适当的抗原负载方法。

尽管已有大量研究报道恶性细胞高表达的肿瘤相关抗原，但其中少有易受T细胞影响的靶点[6]。MUC1是一种高糖基化I型糖蛋白，其蛋白分子较易被免疫细胞所呈递和识别[7]。同时，MUC1的表达具有高度的肿瘤特异性，在胰腺癌细胞中的阳性表达率达90%以上，是胰腺癌免疫治疗的一个重要靶点[8]。

DC-肿瘤细胞融合疫苗与其他形式的肿瘤抗原负载DC相比具有明显的优势：(1)DC-肿瘤融合细胞能表达整个肿瘤细胞抗原决定簇，因而能诱导产生多克隆的CTL反应；(2)DC-肿瘤融合细胞既表达肿瘤抗原，又表达包括MHC、共刺激信号分子在内的DC表面抗原，使细胞介导的抗肿瘤免疫应答大大增强[9]；(3)DC-肿瘤融合疫苗能够将已知和未知的肿瘤相关抗原加工后呈递给T淋巴细胞，发挥最佳的抗肿瘤免疫作用；(4)DC-肿瘤细胞融合后其抗原呈递作用持久[10]，可诱导出更强的免疫应答反应。

本研究采用胰腺癌患者外周血单核细胞来源的DC作为载体，利用50%PEG-10% DMSO 诱导DC融合技术[3]将MiaPaCa-2细胞融合到DC，融合效率达到40%以上，远高于单纯DC组、MiaPaCa-2细胞与DC共培养组，显示此方法是有效的。但DC与胰腺癌MiaPaCa-2细胞融合后细胞存活率较DC组、共培养组显著下降，这与融合剂对DC的毒性蓄积和细胞膜的破坏作用有关。

DC与MiaPaCa-2细胞融合后对自体T细胞的增殖刺激能力显著高于DC组、共培养组，体外激发抗原特异性CTL的IL-2、IL-10、Granzyme B和IFN-γ等细胞因子分泌量也较DC组、共培养组显著增加，提示随着负载抗原效率的增加，DC可增强对肿瘤细胞特异性的杀伤效应，与Van Tendeloo等[11]的研究结果类似，为今后胰腺癌肿瘤细胞与DC融合疫苗的构建开发奠定了部分前期实验基础。

参考文献

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(本文编辑：屠振兴)

In vitro study on the induction of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes by fusion of dendritic cells with pancreatic cancer MiaPaCa-2 cells

YangJinguang,ChenJiang,LiHongyu,GuoXiaozhong.

DepartmentofPharmacy,ThirdHospitalofChengdeCity,Chengde067000,China

【Abstract】Objective To investigate the ability of inducing antigen-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) stimulated by dendritic cell (DC) fused with MiaPaCa-2 cells in vitro. MethodsDC were isolated and cultured from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). 50% PEG and 10% DMSO were used to fuse MiaPaCa-2 cells and DC, and DC co-cultured with MiaPaCa-2 cells and DC alone served as control. The fusion efficiency was assessed by flow cytometry (FCM) and DC-MiaPaCa-2 hybrids were identified as PE-MUC1/FITC-CD86double positive cells. The survival rate of DC was determined by MTT method. The lymphocyte proliferation stimulated by DC in vitro was evaluated by mixed cell culture with DC in different ratios of 1∶10, 1∶20 and 1∶80. IL-2, IL-10, granzyme B and IFN-γ released by antigen-specific CTLs were measured by ELISA assay. ResultsThe fusion rate in DC fused with MiaPaCa-2 cells (fused cells) was (42.30±7.30)%, which was higher than (7.21±1.06)% in DC co-cultured with MiaPaCa-2 cells(co-cultured cells). The cell viability of DC, co-cultured cells and fused cells was >95.0%, 85.0% and 62.8%, and fused cells had greatly lower cell viability than DC and co-cultured cells (P<0.05). When DC and T cells were co-cultured at the ratio of 1∶10, T cell proliferation index in DC, co-cultured and fused cells was 219±42, 3 584±317, 8 201±424, respectively. At the ratio of 1∶20, T cell proliferation index was 110±14, 2 179±104, 6 152±104. T cell proliferation index was higher in fused cells than that in DC and co-cultured cells (both P<0.05) at the ratio of 1∶10 and 1∶20, while the difference was not statistically significant at the ratio of 1∶40 and 1∶80 (P>0.05). At the co-culture ratio of 1∶10, IL-2 secreted by CTL in DC, co-cultured and fused cells was(27.30±5.21 ),(897.44±93.05),(2 243.80±381.46)ng/L; IL-10 was (19.55±2.05),(424.60±108.25),(706.53±161.29)ng/L; Granzyme B was(16.23±1.23),(451.07±120.50),(1327.77±205.15)ng/L; IFN-γ was (30.11±4.32 )、(982.00±124.68)、(2421.04±488.50)ng/L. Cytokines from the antigen-specific CTL induced by DC fused with MiaPaCa-2 cells were significantly higher than those by DC and DC co-cultured with MiaPaCa-2 cells ( all P<0.05). ConclusionsThe fusion of DC and pancreatic cancer MiaPaCa-2 cells could stimulate tumor antigen-specific CTL in vitro.

【Key words】Pancreatic neoplasms;Dendritic cells；Cell fusion;T-lymphocytes, cytotoxic

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.03.003

通信作者：陈江，Email:matrix44@163.com

基金项目：国家自然科学基金(81071982)

Corresponding author:Chen Jiang, Email: matrix44@163.com

(收稿日期：2015-10-15)