HPLC梯度洗脱同步测定泸州产栀子主要有效成分栀子苷和西红花苷-Ⅰ的含量

黄群莲，王利国，唐　灿，黄　易，黄爱玲，孙　琳

(1. 西南医科大学附属医院，四川 泸州646000；2. 西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000；3. 西南医科大学药学院，四川 泸州 646000)



药物研究

HPLC梯度洗脱同步测定泸州产栀子主要有效成分栀子苷和西红花苷-Ⅰ的含量

黄群莲1，王利国2，唐灿3，黄易3，黄爱玲3，孙琳3

(1. 西南医科大学附属医院，四川 泸州646000；2. 西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000；3. 西南医科大学药学院，四川 泸州 646000)

[摘要]目的建立HPLC梯度洗脱同步测定泸州产栀子中栀子苷和西红花苷-Ⅰ含量的测定方法。方法采用高效液相色谱法，使用20RBAX SB-C18键合硅胶柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-水溶液为流动相梯度洗脱：0 min→18 min→20 min→40 min→50 min→55 min，流速1 mL/min，变波长检测:0～30 min，238 nm，30～60 min，440 nm，柱温35 ℃。结果泸州产栀子中栀子苷质量分数均在31.7 mg/g以上，西红花苷-Ⅰ均在5.58 mg/g以上。栀子苷的积分面积A与进样量M线性回归方程为A=1 963.231M+9.151 108(r2=0.999 991)，进样量在0.132 5～10.6 μg范围内线性关系良好。西红花苷-Ⅰ积分面积A与进样M线性回归方程A=4 539.579M+14.504 24(r2=0.999 991)，进样量在0.021～1.68 μg范围内线性关系良好。结论该方法分离良好，测定准确，重复性好，可同时测定栀子中栀子苷和西红花苷-Ⅰ两种有效成分,为全面控制泸州产栀子质量提供了可靠的科学依据。

[关键词]栀子;栀子苷;西红花苷-Ⅰ;高效液相色谱;梯度洗脱

泸州地理位置优越，气候温和，四季分明，气候适宜作物生长[1-2]，中药材极为丰富，是四川省重点药材产区之一，素有“药材之乡”的美称。中药材资源主要品种有赶黄草、黄栀子、石斛、青果、青蒿、黄柏、杜仲、天麻等[3]。 栀子(Gardenia jasminoides Eillis)见于《神农本草经》，是茜草科(Rubiacece)栀子属(Gardenia)的一种常绿灌木的果实，具有清热除烦、凉血解毒之功效，是生产“清开灵”“安宫牛黄丸”“龙胆泻肝丸”“清热解毒颗粒”[4]“茵栀黄注射液”等中成药的重要原料。国内栀子药材资源丰富，但多数为野生资源，缺乏规范的管理[5]。目前市场上流通的栀子药材，因受产地来源、采收时间、储藏时间及基原植物的影响，质量参差不齐。在栀子药材的质量控制指标中，2010年版《中国药典》一部仅规定了测定栀子苷的含量，然而栀子苷并非栀子药材的唯一有效成分[6]。栀子在医疗、保健、食品等方面应用较广，因此仅将栀子苷作为质量评价的唯一指标显然不够，还应将具有显著药理作用及应用价值的色素类成分如西红花苷-Ⅰ也列为质量评价指标。而通过测定泸州产栀子主要有效成分栀子苷和西红花苷-Ⅰ的含量,能指导药农科学种植栀子，提高泸州产栀子药材的品质和规模，形成规范化大规模栀子GAP种植基地，为地方中药企业提供优质栀子原药材，促进泸州经济发展。

1试验材料与仪器

1.1试验材料

1.1.1试验药材野生及个体户种植的栀子，采自泸州纳溪区和龙马潭区，经课题组鉴定均为茜草科植物栀子(Gardenia gasminoides Ellis)和水栀子(G.jaminoides Ellis.f.logica-rpa Z.W. Xie et OKada)的干燥成熟果实。采集后进行干燥，研磨成粗粉，备用。

1.1.2药品与试剂栀子苷(供含量测定用，中国药品生物制品检定所，约20 mg,批号 ：110742-200516);西红花苷-I(供含量测定用，中国药品生物制品检定所，约20 mg,批号:111588-00501);乙腈(色谱纯，上海星可生化有限公司);甲醇(分析醇，四川西陇化工有限公司);80%甲醇:量取甲醇160 mL,蒸馏水40 mL,配制成80%甲醇200 mL;蒸馏水(西南医科大学附属医院药剂科);无水乙醇(分析纯，重庆川东化工有限公司)。

1.2试验仪器高效液相色谱仪(型号为Agilent Q60);20RBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,Agilent Technologies);电子天平(FA1104N型,上海民桥精密科学仪器有限公司);超声震荡仪(AS2060B型,天津奥特塞恩斯仪器有限公司)。2 mL透明带刻度螺旋口样品瓶,11.6×32 mm,5.0玻璃(适合安捷伦HPLC);红色特氟龙/白色硅胶隔垫，Φ9 mm×1 mm;蓝色开口聚丙烯盖，Φ9 mm,中心孔径6 mm;GM-0.33A隔膜真空泵(天津市津腾实验设备有限公司);T-50砂芯过滤装置抽滤装置(1 000 mL)天津市津腾实验设备有限公司);一次性针头式滤器水系混合纤维素膜25 mm×0.22 μm；微孔滤膜水系滤膜(Ф50 mm×3 μm,50片/盒,上海新亚有限公司)。

2试验方法

2.1预前处理

2.1.1样品的处理将采集到的栀子逐一先按产地，再按红果、黄果、绿果进行分类。将分类好的栀子竖切成两半，放入烘干箱中调至50 ℃进行烘干[7]。记录样品编号如表1。

表1　栀子样品来源

2.1.2供试品溶液的制备取干燥后的栀子用铁研锤进行研磨，过16号筛。分别称取各地待测栀子样品，粉末质量见表2。将称取好的栀子粉末，分别置于150 mL锥形瓶中，用移液管精密加入80%甲醇40 mL超声2 h。将锥形瓶拿出来放凉，摇匀，放置，然后用漏斗过滤，得到供试品溶液。用翻口瓶进行密封，放于冰箱冷藏室中保存，并贴好标签。取适量供试品溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得待试溶液。

表2　各地栀子称取质量

2.1.3对照品溶液的制备对照品溶液的制备 精密称取栀子苷对照品5.3 mg,置于5 mL量瓶中，用80%甲醇溶解定容至刻度，即得1.06 mg/mL栀子苷对照品；精密称取西红花苷-I对照品4.20 mg,置于25 mL量瓶中，用80%甲醇溶解定容至刻度，即得0.168 mg/mL西红花苷-I对照品溶液[8]。

2.2色谱条件色谱柱：20RBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相：乙腈-水溶液，梯度洗脱：0 min→18 min→20 min→40 min→50 min→55 min,乙腈10%→18%→28%→38%→50%→10%;检测波长：0～30 min,238 nm,30～60 min,440 nm;柱温35 ℃；流速1 mL/min;进样量5 μL[9]。

2.3色谱系统适用性试验以栀子苷、西红花苷-Ⅰ峰计算，测得理论塔板数分别为28 765，724 792。栀子苷、西红花苷-Ⅰ和前后的色谱峰达到基线分离,对称因子分别为0.67，0.68，峰形基本对称。在测定时比较稳定，峰面积也较大，因此二者可以选作参照物峰。见图1及图2。

图1　栀子苷对照品HPLC色谱图

图2　西红花苷-Ⅰ对照品HPLC色谱图

2.4线性关系考察精密称取标准品10.6 mg置于10 mL容量瓶中,加80%甲醇至刻度，精密量取5 mL栀子苷对照品溶液，5 mL西红花苷对照品，置于10 mL容量瓶中备用。对照品溶液进样量:浓度不变，双重进样时依次按0.3,0.5,1,2,5,8,16,20 μL分别注入液相色谱仪，按 2.3项下的色谱条件进行测定。结果见表3。以对照品进样量(g)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。栀子苷积分面积A与进样量M线性回归方程:A=1 963.231M+9.151 108,r2=0.999 991,进样量在0.132 5～10.6 μg范围内线性关系良好,见图3。西红花苷-Ⅰ积分面积A与进样量M线性回归方程：A=4 539.579M+14.504 24，r2=0.999 991，进样量在0.021～1.68 μg范围内线性关系良好，见图4。

3结果

对照品以及各地采集的栀子供试品HPLC图谱见图5～13。根据供试品HPLC图谱峰面积计算各得测品含量，结果见表4及表5。

4讨论

《中国药典》2010版一部载有栀子苷HPLC含量测定方法。栀子苷的含量是药用栀子优选中的一个很重要的指标，但现代药理实验证明，中药材是个复杂体系，仅将栀子苷作为栀子的质量评价指标是不够的，很有必要将其中具有显著抗炎活性的有机酸类物质及具有明显降血脂及抗肿瘤作用的西红花苷类的测定作为栀子药材质量评价指标之一[10]。

表3　线性关系考察结果

图3　栀子苷对照品标准曲线图

图4　西红花苷-Ⅰ对照品标准曲线图

图5　NX1样品图HPLC色谱图

图6　NX2样品HPLC色谱图

图7　NX3样品HPLC色谱图

图8　NX6样品HPLC色谱图

图9　NX7样品HPLC色谱图

图10　QL1样品HPLC色谱图

图11　QL4样品HPLC色谱图

图12　QL5样品HPLC色谱图

图13　BZ3样品HPLC色谱图表4　西红花苷-I的检测结果统计表

编号药材质量/g西红花苷-Ⅰ面积西红花苷-Ⅰ进样量/μg西红花苷-Ⅰ浓度/(μg/μL)西红花苷-Ⅰ质量分数/(mg/g)NX15.046411270.70.88980.17807.0526NX25.000412292.10.97050.19417.7630NX35.016310542.00.83220.16646.6356NX65.076512040.00.95060.19017.4899NX75.055011894.80.93910.18787.4309QL15.004513814.71.09080.21828.7189QL45.031012690.71.00200.20047.9666QL55.07298972.30.70810.14165.5832BZ30.943613524.61.06790.21369.0539

表5　栀子苷的检测结果

栀子黄色素的主要成分为以西红花苷-Ⅰ为主的西红花苷类成分，具有利胆、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用[11]。在试验过程中，西红花苷-I的重复性试验，检测出的结果差异较大。经分析，可能是因为试验过程中没有注意避光保存，样品在日光照射下发生了化学反应，应注意取样后及时将其避光保存。此外，在本次试验中栀子超声震荡提取前未进行浸泡，可能会降低提取的有效成分含量。

从本研究结果可知，NX3、QL5这两个绿果期的西红花苷-Ⅰ含量比其他的样品低，而栀子苷的含量比较高。而红熟期栀子NX6、QL1、BZ3栀子苷峰面积依次下降，此时西红花苷-Ⅰ含量均比黄果和青果时期的含量高。

山栀子是传统中药，有泻火除烦、凉血散瘀的功效，在临床中应用甚广。水栀子主要作为工业和食品的黄色天然着色原料。两者所含的环烯醚萜苷类成分之一栀子苷(geniposide)为有效成分，水栀子果实大，产量高，易于栽培管理[12]。通过测定和比较二者所含栀子苷的不同，可以推断水栀子是否能作为一种传统中药材的代用品。

本试验中提取后的样品溶液虽放入翻口瓶中密封，并置于冰箱中冷藏保存。但由于试验的时间较长，瓶中溶液出现了不同程度的结晶。经查阅文献，由于栀子黄色素在冷藏过程中容易产生沉淀。其产生沉淀的原因主要是2价和3价金属离子特别是Ca2+的存在容易引起溶液中部分成分的聚沉[12]。在本次试验中采用的处理方法是用超声震荡仪进行短时间的震荡以除去沉淀，肉眼见均一的澄清溶液。

试验中使用的梯度洗脱方法是参照王子雯等[9]2013年发表的“巴中产栀子不同采收期指纹图谱的比较研究”所实践过的方法。但在试验过程中，几次出现柱压过高导致的仪器停止运行的情况，可能是仪器老化导致，或是因为过滤系统的清洗不够彻底。本研究中尝试将常用型号的0.45 μm过滤头换成了0.22 μm的过滤头，增加预柱以排除干扰。

文中建立的RP-HPLC法，利用紫外检测器，通过HPLC 系统中的操作软件进行程序设定，采用变波长、梯度洗脱的方法，在同一色谱条件下能够同时检测栀子中的栀子苷类和西红花苷-Ⅰ成分，由HPLC图谱可看出供试品中各组分与其他组分均能达到基线分离，且基线平稳。该方法简便，重复性好，比现行药典方法更能全面客观地反映栀子药材质量，在栀子内在成分含量测定上具有一定的创新性，可为提高栀子质量控制方法提供参考。

该地栀子药材栀子苷的质量分数均在31.7 mg/g以上，平均质量分数为46.5 mg/g，说明泸州地区栀子药材所含化学成分随产地的变化小，产区栀子质量优良。栀子苷含量均高于药典的要求(18 mg/g)，符合国家药用标准。

西红花苷-Ⅰ浓度最低为5.6 mg/g, 最高达9.1 mg/g, 含量相差近一倍。作为提取西红花苷类色素的原料,同一产区的栀子也应有所选择。栀子苷与西红花苷-Ⅰ含量无明显关系。

经本研究数据分析结果可以看出，以栀子提取栀子苷入药，则以青果期栀子为佳。但若要提取西红花苷-I或主要以西红花苷-I入药，则以红熟期栀子更好[14]。

[参考文献]

[1]方云祥,刘泉. 泸州市生态经济系统的能值分析[J]. 安徽农业科学,2012,40(8):4826-4828

[2]吴贵阳，李燕梅. 论泸州市建立中草药生态育种园的必要性[J]. 泸州科技，2015(1):22-23

[3]吴贵阳. 关于利用优势资源加快发展泸州中医药产业的建议[J]. 泸州科技,2013(1):22-23

[4]索风梅，谢彩香，陈士林,等. 常用药材栀子生态适宜性数值分析[J]. 湖北中医学院学报，2009，11(6):3-8

[5]付小梅,赖学文,葛菲，等. 中药栀子类药材资源调查和商品药材鉴定[J]. 中国野生植物资源,2002,21(5):23-25

[6]刘武占,范建伟,高艳红，等. HPLC同时测定栀子中8个环烯醚萜苷类成分的含量[J]. 中国中药杂志,2012,37(16):2417-2421

[7]陈红,唐灿,黄锐. 优选栀子提取工艺[J]. 泸州医学院学报,2011,34(1):36

[8]唐灿，王子雯，孙嘉婧，王刚，等. 多指标综合评价巴中栀子的品质[J]. 中国实验方剂学杂志2012，18(24):115-119

[9]王子雯，唐灿，何峰. 巴中产栀子不同采收期指纹图谱的比较研究[D]. 泸州：泸州医学院，2013

[10] 任治军，张立明，何开泽. 栀子主要有效成分提取工艺及药理研究进展[J]. 天然产物研究与开发，2005,17(6):831

[11] 付小梅，王峥涛. 西红花苷-1的稳定性研究[J]. 食品科学,2012,33(5):71-73

[12] 蒋珍藕. 山栀子和水栀子中栀子甙的含量分析[J]. 广西中医药,1995,18(1):50

[13] 何兵,田吉. 不同成熟期和不同部位栀子中4种主要活性成分的含量变化[J]. 药物分析杂志,2010,30(5):801-805

[14] 王子雯，唐灿，孙嘉婧，等. 多指标综合评判巴中产栀子的采收期和生长期[J]. 药物分析杂志，2012,32(9):1554-1558

[通信作者]唐灿，E-mail：Tang9670625@163.com

[基金项目]四川省科技厅联合专项项目(14ZC0045)；泸州市政府联合专项项目(2013LZLY-K69)；四川省科技支撑计划项目(2011SZ0048)；四川省科技支撑计划项目(2010SZ0049)；四川省教育厅重点科研项目(2005A071)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.19.035

[中图分类号]R965.2

[文献标识码]B

[文章编号]1008-8849(2016)19-2148-05

[收稿日期]2015-12-15