烟草中溴菌腈农药残留检测方法及消解动态

周杨全，徐光军，徐金丽，张纪利，苏 赞，王 鹏，李明光，邓东强，胡亚杰*

（1.中国农业科学院烟草研究所，国家烟草专卖局病虫害监控与综防重点实验室，青岛 266101；2.广西中烟工业有限责任公司，南宁 530001；3.山东青岛烟草有限公司，青岛 266000）



烟草中溴菌腈农药残留检测方法及消解动态

周杨全1，徐光军1，徐金丽1，张纪利2，苏 赞2，王 鹏3，李明光3，邓东强3，胡亚杰2*

（1.中国农业科学院烟草研究所，国家烟草专卖局病虫害监控与综防重点实验室，青岛 266101；2.广西中烟工业有限责任公司，南宁 530001；3.山东青岛烟草有限公司，青岛 266000）

摘 要：为摸清溴菌腈在烟草中的农药残留消解动态规律及残留特征，建立了QuEchERS前处理和气相色谱-串联质谱（GCMS/MS）检测相结合的烟叶中溴菌腈残留量的分析方法。烟叶经乙腈提取，N-丙基乙二胺吸附剂（PSA）净化，气相色谱-串联质谱法检测。结果表明，在 0.01～1.0 mg/kg 3个添加水平下，溴菌腈在鲜烟叶和干烟叶中的平均回收率分别为85.8%～94.5%、83.2%～110.0%，相对标准偏差（RSD）分别为1.4%～10.6%、7.3%～14.1%，定量限（LOQ）均为0.01 mg/kg。利用山东和湖南2年2地的溴菌腈在烟叶中农药残留田间试验样品进行了深入研究，溴菌腈在烟叶中的半衰期7.8～14.9 d；按照162 g.a.i./hm2和243 g.a.i./hm2剂量，分别灌根施药1～2次，末次施药14 d后，溴菌腈在烟叶样品中的最终残留量为0.010～0.13 mg/kg。根据烟草青枯病发病条件、发病时期、农药在烟叶中使用情况及OECD农药残留限量计算结果，建议溴菌腈在烟叶中残留限量为0.2 mg/kg，安全间隔期为14 d。

关键词：溴菌腈；烟草；残留；QuEChERS；气相色谱-串联质谱

溴菌腈（bromothalonil）是一种广谱、高效、低毒的内吸性杀菌剂，能抑制和铲除真菌、细菌、藻类的生长，对农作物多种真菌性、细菌性病害［1-5］以及烟草青枯病具有较好的防治效果。研究溴菌腈在烟草中的农药残留消解动态及残留特征，可以为制定溴菌腈在烟草上的合理用量和残留限量提供科学依据。刘伟等［6］、刘慧群［7］建立了气相色谱法检测溴菌腈在苹果、黄瓜及土壤中残留量方法并研究了残留降解规律。目前，国内外尚无该农药在烟草上降解规律和残留特征的研究报道。近年来，QuEChERS技术作为液液萃取和固相萃取的替代前处理方法，已经成功应用于多种有机物的提取和净化［8-11］，在烟叶农药残留的前处理过程中的应用也较为广泛［12-13］。本研究建立了QuEChERS提取净化，GC-MS/MS检测烟草中溴菌腈农药残留量的方法，并对山东和湖南GAP试验条件下，烟叶中溴菌腈农药残留量和消解动态进行了检测和研究，对该农药安全使用提出建议。

1　材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱-串联三重四极杆质谱（TSQ QUANTUM XLS，德国Thermo fisher公司）；千分之一电子天平（SHIMADZU-UW 420 H，日本Shimadzu公司）；万分之一电子天平（ER-182 A，日本Tykyo公司））；超声波振荡机（RSQ-60 AS，宁波荣顺）；回旋式振荡器（BLUD PARD WSZ-200 A，上海蓝豹）；旋转蒸发仪（HEIDOLPHADVANTAGE，德国海道尔夫）。

95%溴菌腈标准品（美国Sigma-Aldrich公司）；25%溴菌腈·壬菌铜微乳剂（溴菌腈含量为 20%，潍坊万胜生物农药有限公司）；乙腈（色谱纯，99.9%，德国默克股份两合公司）；丙酮（99.5%，烟台三和化学试剂有限公司）；无水硫酸镁（98.0%，国药集团化学试剂有限公司）；氯化钠（99.5%，西陇化工股份有限公司）；柠檬酸钠（99.0%，国药集团化学试剂有限公司）；柠檬酸氢二钠（99.0%，国药集团化学试剂有限公司）；N-丙基乙二胺吸附剂（99.5%，天津市天兴达科技有限公司）。

1.2 田间试验

分别于2012—2013年在山东青岛（土壤为砂性棕壤，pH值为6.4，有机质含量1.79%，中等肥力）、湖南长沙（土壤为红壤，pH为5.9，有机质含量1.56%，中等肥力）进行了田间试验，供试烟草品种为NC89（山东）和云烟87（湖南），整个田间生产过程符合当地GAP生产要求。试验农药为 25%溴菌腈·壬菌铜微乳剂（溴菌腈含量为20%）。农药登记资料显示，该农药防治烟草青枯病，总用量为112.5～202.5 g.a.i./hm2（溴菌腈用量90～162 g.a.i./hm2），施药方式为灌根，次数为1次。按《农药残留试验准则》［14］要求，设置 243 g.a.i./hm21次施药，243 g.a.i./hm22次施药，162 g.a.i./hm21次施药，162 g a.i./hm22次施药共4个最终残留量试验及1个消解动态试验，合计5个处理区。每小区面积30 m2，重复3次，随机排列，小区间设保护带，另设对照小区。

1.2.1 农药残留消解动态试验 旺长后期施药，按照溴菌腈用量243 g.a.i./hm2，用水量900 L/hm2，叶面均匀喷雾。施药后1 h，1、3、5、7、14、21、28、35、42 d采样。在试验小区内随机采集1 kg生长正常、无病害烟叶，切碎、混匀，四分法留样200 g，-20 ℃保存，待测。

1.2.2 烟叶最终残留量试验 4个处理区灌根施药，每株药液量50 mL，最后一次施药后7、14、21 d，随机采集烟叶样品不少于100片，三段式烘烤工艺烘烤，粉碎、缩分后取200 g，-20 ℃保存。

1.3 分析方法

1.3.1 样品的提取与净化 提取：称取鲜烟叶样品5.0 g（或干烟叶样品2.0 g，加2 mL蒸馏水，轻摇使样品润湿，静置5 min）于50 mL具盖离心管中，加入10 mL乙腈，于漩涡混合振荡器上振荡提取1 min，加入4 g无水硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠，立即于漩涡混合振荡仪振荡2 min，防止无水硫酸镁结块，然后以4000 r/min离心10 min。净化：移取1.5 mL上清液于2 mL离心管中，加入150 mg无水硫酸镁和25 mg N-丙基乙二胺键合固相吸附剂，于漩涡混合振荡仪上漩涡振荡2 min，以13000 r/min离心5 min，吸取上清液1.0 mL，浓缩近干，加入1 mL正己烷/丙酮（V∶V，7∶3）溶解，待测。

1.3.2 仪器条件 色谱柱：HP-5 MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Agilent公司）；载气：氦气 （ 纯度99.999%）；恒流模式：流速1.0 mL/min；进样口温度：250 ℃；传输线温度：250 ℃；柱温：初始温度50 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至280 ℃，保持3 min；进样量：1 µL。

质谱条件：离子源温度：250 ℃；保留时间：5.4 min，定性离子对（m/z）：106.0/66.1，106.0/79.1；定量离子对（m/z）：106.0/66.1；碰撞能量：10 ev。

1.3.3 标准曲线的绘制 100 mg/L的溴菌腈标准溶液逐级稀释，得到浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L的系列工作标准溶液，在上述仪器条件下测定，以溴菌腈进样量（mg/L）为横坐标，对应色谱测定峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.4 添加回收率试验 分别在空白鲜烟叶、干烟叶中添加0.01、0.2和1.0 mg/kg浓度的溴菌腈标准溶液，按照1.3.1和1.3.2的方法提取、净化、检测。每个水平重复5次，同时设空白对照。

1.3.5 数据分析 采用 SPSS 22.0进行单因变量多自变量随机区组分析。

2　结果

2.1 检测条件的优化

柱箱初始温度与最终温度及持续时间，是影响溴菌腈出峰时间的重要因素，通过优化试验，选定条件为：初始温度50 ℃，保持1 min，最终温度280 ℃，保持3 min。在选定的气相色谱条件下，采用全扫描（SCAN）方式检测，对溴菌腈进行定性分析，并选择特征检测离子对106.0/66.1和106.0/79.1。之后选择SIM扫描方式，对其进行定量分析，发现特征检测离子对 106.0/66.1的检测灵敏度高，选择性好，定量准确。

2.2 方法的线性范围与检出限

在0.01～5.0 mg/L范围内，溴菌腈峰面积与质量浓度间呈良好的线性关系，方程为Y=11530369X-96331（鲜叶）、Y=12661040X+77811（干叶），相关系数均为r=1.0。

根据添加回收率试验，在选定的样品前处理方法和检测条件下，溴菌腈在干烟叶和鲜烟叶中的定量限（LOQ）均为0.01 mg/kg。

2.3 方法的准确度及精密度

在鲜烟叶和干烟叶中分别添加0.01、0.2、1.0 mg/kg 3个水平，结果见表1。在0.01～1.0 mg/kg的添加水平下，溴菌腈在鲜烟叶样品中的平均回收率为 85.8%～94.5%，相对标准偏差（RSD）为1.4%～10.6%；在干烟叶样品中的平均回收率为83.2%～110.0%，相对标准偏差（RSD）7.3%～14.1%，均符合农药残留试验准则中对残留检测方法的要求［15］，可以用于实际样品的分析与检测。

表1　溴菌腈在烟叶中的添加回收率及相对标准偏差Table 1 Average recovery and relative standard deviation of bromothalonil in fresh and cured tobacco leaves

2.4 溴菌腈在烟叶中的消解动态和最终残留

2.4.1 溴菌腈在烟叶中的消解动态 由图1看出，溴菌腈在植株中的原始沉积量分别为 0.088～0.84 mg/kg，当1 d和3 d时，溴菌腈在烟叶中的消解率超过50%；28 d和35 d时，消解率超过90%。不同试验地点品种、气候、烟株长势等条件的影响，烟叶中农药残留降解有一定差异。

动力学方程拟合结果（表2）表明，溴菌腈在烟叶的消解符合一级动力学特征。烟叶中溴菌腈的半衰期为7.8～14.9 d。

2.4.2 溴菌腈在烟叶中的最终残留 山东、湖南2 年2地试验结果表明（表3），末次施药7 d，14 d 后2年2地溴菌腈的最终残留量均为0.010～0.13 mg/kg；21 d后 2年 2地溴菌腈的最终残留量＜LOQ～0.078 mg/kg。

2.5 施药因子对烟叶中溴菌腈残留量的影响

由表4看出，施药次数对农药残留量呈显著相关关系，施药剂量和采收间隔对残留量相关性影响不显著。

表2　溴菌腈在烟叶中的消解动力学方程及其相关系数Table 2 Residue dissipation of bromothalonil in fresh tobacco leaves

图1　溴菌腈在烟叶中的残留消解动态Fig. 1 Residue dissipation of bromothalonil in cured tobacco leaves

表3　溴菌腈在干烟叶中的最终残留量 mg/kgTable 3 The terminal residue of bromothalonil in cured tobacco leaves

表4　施药因子对残留量影响随机区组分析Table 4 Composite factors randomized block analysis of pesticide residue

3　讨论

本研究建立了以QuEchERS前处理方法提取净化、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）检测烟草中溴菌腈农药残留的方法。与文献报道的该农药在其他农作物的农药残留方法相比［6-7］，操作简单，省时省力，有机溶剂使用少，经济成本低。

由溴菌腈在烟叶中的残留消解动态可以看出，该农药降解较快，不同试验地点和试验年度，烟叶中农药残留降解速率差别较大。王秀国等［16］认为，内吸性杀菌剂施用后会很快被吸收到烟草植株体内，烟草植株本身的生长发育及生理生化特性会影响其对内吸性杀菌剂的吸收传导。此外，大田试验期间温度、降雨和光照等因素均会影响溴菌腈在烟叶中的残留消解趋势。施药期间，烟叶质量和体积均迅速增长，对降低烟叶农药残留方面也有一定的作用［17］。

由溴菌腈在干烟叶中的最终残留量及影响因素可以看出，灌根施药后，溴菌腈在烟叶中残留量较低，且残留量与采收间隔期和施药次数显著相关，采收间隔期越长，残留量越低，施药次数越多，残留量越高。在烟叶生产中，青枯病大多为成株期发病，施用此农药可以保证烟叶安全水平，由于施药次数和安全间隔期对农药残留量有显著影响，宜采用推迟采收时间的措施控制农药残留量，发病严重的区域可以适当增加农药施用剂量，对烟叶农药残留量影响较小。

我国和CORESTA都未制定溴菌腈在烟草中最大残留限量（MRL），根据7、14、21 d农药残留数据结果，经OECD农药残留限量计算器计算，7、14 d时MRL值均为0.2 mg/kg，21 d时MRL 为0.15 mg/kg。根据烟草青枯病发病条件、发病时期和农药在烟叶中使用情况，建议溴菌腈在烟叶中残留限量为0.2 mg/kg，安全间隔期为14 d。

4　结论

建立了QuEchERS前处理和气相色谱-串联质谱相结合的烟叶中溴菌腈残留量的分析方法，该方法净化效果好，方法检出限、精密性、准确度均符合农药残留分析方法要求。

根据农药残留试验数据和病害发病特征，使用25%溴菌腈·壬菌铜微乳剂防治烟草青枯病，在发病初期，溴菌腈用量90～162 g.a.i./hm2灌根施药1次。建议溴菌腈在烟叶中残留限量为0.2 mg/kg，安全间隔期为14 d。

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Residue Analysis and Dissipation of Bromothalonil in Tobacco

ZHOU Yangquan1，XU Guangjun1，XU Jinli1，ZHANG Jili2，SU Zan2，WANG Peng3，LI Mingguang3，DENG Dongqiang3，HU Yajie2*
（1. Tobacco Research Institute of CAAS，Key Laboratory of Tobacco Pest Monitoring Controlling & Integrated Management，Qingdao 266101，China；2. China Tobacco Guangxi Industrial Co.，Ltd.，Nanning 530001，China；3. China Tobacco Shandong Qingdao Co.，Ltd.，Qingdao 266000，China）

Abstract:To study residue and dissipation of bromothalonil in tobacco，a modified QuEChERS combined with gas chromatography triple quadrupole-tandem mass-spectrometry （GC-MS/MS） liquid chromatography-tandem mass spectrometry method was developed. Samples were extracted with acetonitrile，cleaned up with primary secondary amine （PSA），and then determined with GC-MS/MS. The results showed that the average recoveries of bromothalonil were 85.8%-94.5% and 83.2%-110.0%，with relative standard deviations （RSDs） of 1.4%-10.6% and 7.3%-14.1% in fresh and cured tobacco leaves，respectively. The limit of quantification （LOQ） of this method was 0.01 mg/kg for both fresh and cured tobacco leaves. The dissipation and terminal residues were investigated in Qingdao and Changsha，China from 2012 to 2013. The dynamic results showed that the half-life of bromothalonil in fresh tobacco leaves was 7.8-14.9 d. The terminal residues of bromothalonil in cured tobacco leaves were determined after the first and second application at levels of 162 g.a.i/hm-2and 243 g.a.i/hm-2. The terminal residues were 0.010-0.13 mg/kg 14 days after the last application in cured tobacco leaves. Based on the tobacco bacterial wilt incidence conditions，the incidence period，the use of pesticides in tobacco and OECD MRL calculator findings，we recommend the residue limit of bromothalonil in tobacco leaves of 0.2 mg/kg，and the safety interval of 14 d.

Keywords:bromothalonil；tobacco；residue；QuEChERS；gas chromatography-tandem mass-spectrometry

中图分类号：S345.72

文章编号：1007-5119（2016）01-0067-05

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.01.012

基金项目：广西中烟工业有限责任公司项目“广西中烟原料质量安全评价体系建设与应用”（GXZX-2014-02）

作者简介：周杨全，男，硕士研究生，研究方向为烟草植物保护。E-mail：zhouyangquan0413@163.com。*通信作者，E-mail∶ 312665054@qq.com

收稿日期：2015-07-27 修回日期：2016-01-2