苯甲酸降解菌的分离鉴定及其对烤烟幼苗生长的影响

李 鑫，王 丰，周冀衡，李 强，邵建平，赵 杰，王瑞宝，许 计，李亚兵，李 超

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，长沙410128；2.湖南农业大学烟草研究院，长沙 410128；3.贵州省黔西南州烟草公司，贵州 兴义 562400；4.曲靖市烟草公司罗平县分公司，云南 罗平 655800）



苯甲酸降解菌的分离鉴定及其对烤烟幼苗生长的影响

李 鑫1，2，王 丰3，周冀衡2*，李 强2，邵建平4，赵 杰4，王瑞宝4，许 计4，李亚兵4，李 超4

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，长沙410128；2.湖南农业大学烟草研究院，长沙 410128；3.贵州省黔西南州烟草公司，贵州 兴义 562400；4.曲靖市烟草公司罗平县分公司，云南 罗平 655800）

摘 要：为降低烟草连作对烟叶产量和品质以及烟草生长发育带来的不良影响，通过平板筛选和摇床复筛，从烤烟根系分泌物中筛选出一株能高效降解苯甲酸的菌株。结果表明，根据rDNA-ITS的扩增及序列分析、培养特征及形态特征观察初步鉴定该菌株为黄曲霉（Aspergillus flavus）；该菌株培养15 d内，在0～800 μmol/L苯甲酸浓度范围内能够正常生长，800～1600 μmol/L苯甲酸浓度范围内生长受到一定程度抑制；该降解菌在以苯甲酸为唯一碳源的800 μmol/L浓度LBA培养基中菌株干重、降解率均达到最大，菌株干重为0.765 g，降解率为19.98%；菌株在培养至第9天时降解速率达到最快，为8.5 mg/d；烤烟幼苗生长过程中施加降解菌液能在一定程度上降低根系分泌物的抑制作用。该降解菌株在盆栽试验中能够降低根系分泌物对烤烟的自毒作用，使微生物菌株降解烤烟自毒物质来克服连作障碍成为可能。

关键词：烤烟；苯甲酸降解菌；分离鉴定；连作障碍

鉴于我国农田种植制度、土地流转方式及经济效益方面的考虑，烟草连作障碍依然普遍，已成为制约我国烟草农业发展的障碍之一［1-4］。烤烟根系在生长过程中会分泌一些有害物质，在土壤中积累到一定程度时会抑制烤烟本身及其他作物的生长，同时导致土壤理化性状恶化、土传病害日趋严重。烤烟根系分泌物释放的烟碱、水杨酸、苯甲酸、2-羟基丙酸等［5-6］均可降低植烟土壤利用率和烟叶品质。有研究报道，采用作物轮作［7］、施用土壤改良剂［8-9］和微生物肥料等［10］方法，可以缓解由于营养元素失衡和土传病害增多引起的连作现象，但关于烤烟自毒物质的生物可降解性报道还不多见，只有毛宁等［11］、苗艳芳等［12］和周治等［13］对植物根系分泌物降解菌有少许研究。上述研究主要针对细菌和放线菌，关于真菌的研究较少，尤其真菌对苯甲酸降解效果研究未见报道。本研究针对烤烟连作自毒作用的生物降解菌进行分离筛选，对分离的菌株进行分子生物学鉴定，并进行盆栽试验验证其降解效果，进一步探讨利用微生物菌株降解烤烟自毒物质的可行性，为烤烟连作障碍修复提供科学依据。

1　材料与方法

1.1 供试培养基

真菌培养选用马丁氏培养基，活化培养及保存方法参照文献［14］以苯甲酸为唯一碳源真菌培养基：磷酸二氢钾1 g，七水硫酸镁0.5 g，1/300孟加拉红水溶液3 mL，pH自然，定容至1 L，固体培养基用于降解苯甲酸真菌的筛选；液体培养基分装后，加入苯甲酸，使苯甲酸的终浓度分别为400（设为T1）、800（T2）、1200（T3）、1600（T4）及2000（T5）μmol/L，用于真菌对苯甲酸降解测定。

1.2 真菌的分离与纯化

真菌按照常规方法进行分离和纯化［15］：按照文献［16］方法制备烤烟根系分泌物，取1 mL烤烟根系分泌物均匀涂布于马丁氏培养基中，28 ℃黑暗条件下培养7 d。在菌落形成后挑取单个菌落置于以苯甲酸为唯一碳源的固体真菌培养基中，28 ℃黑暗条件下培养。待长出单菌落后，挑取单孢纯化，纯化后的菌株保存于LBA培养基斜面上，置4 ℃冰箱中保存备用。

1.3 真菌鉴定

1.3.1 形态学鉴定 将分离纯化得到的真菌接种到LBA平板上，28 ℃黑暗培养，观察菌落形态；7 d后从平板上挑取少量菌丝进行镜检，观察孢子形态及其产生方式。

1.3.2 rDNA-ITS扩增及序列分析 将分离得到的真菌接种于LBA培养基中，在28 ℃黑暗条件下培养3 d。用灭菌牙签挑取少量菌丝用于DNA提取。DNA提取参照Lee等［17］的方法。利用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物ITS1（5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´）和 ITS4（5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´）对病原菌的rDNA-ITS区进行PCR扩增［18］。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，共30个循环；最终72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，测序结果在GenBank数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov）中进行BLAST比对分析。

1.4 降解菌液对烤烟幼苗生长的影响

幼苗生长试验于2013年8月至2013年10月，在贵州省烟草科学研究院人工大棚中进行，采用常规育苗盘育苗，育苗基质由云南省丘北县烟用物资有限责任公司提供。8月1日开始播种，育苗15 d后间苗（8月15日），间苗后每穴留有1株烟苗，后向育苗盘中每天下午浇入50 mL相应处理液，连续灌浇45 d，含有降解菌的处理液在浇入前12 h即在常温下混匀。采用随机区组设计，共设3个处理液处理，每个处理3个重复（即3盘幼苗），每个重复12株烟苗。3个处理中M1处理为自来水设为CK，M2处理为烤烟根系分泌物，M3处理为降解菌液和烤烟根系分泌物的混合液。M3处理的混合处理液以降解菌液5 mL，分泌物45 mL进行分配。待幼苗生长60 d（10月1日）后测量其根系结构、叶绿素含量和光合特性等各类指标。

1.5 测定项目

1.5.1 降解菌干重和苯甲酸降解速率测定 在马丁氏培养基中取5 mm降解菌菌丝块无菌操作移到T1-T5等5个以苯甲酸为唯一碳源浓度处理溶液培养基中进行培养，每个处理3个重复，连续培养15 d。在降解菌培养至15 d时取出降解真菌，过滤、干燥（60 ℃，2 h）、称量，同时每隔3 d测量一次不同浓度LBA培养基中苯甲酸含量，连续测量15 d。苯甲酸含量测定采用文献［19］方法测量，并称量。

1.5.2 烤烟幼苗生长相关生理指标测定 选取长相一致具有代表性的烟苗根系，采用 WinRHIZO植物根系扫描分析系统（北京易科泰生态技术有限公司）测定幼苗根系结构。采用Li-6400XT便携式光合作用测定仪和6400-02B红蓝光源（美国Li-cor公司）测定幼苗光合指标。采用丙酮提取-TU1901紫外分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）测定幼苗叶绿素各类指标。

试验数据采用Microsoft Excel 2003软件进行处理，采用SPSS18.0软件进行差异显著性分析。

2　结果

2.1 降解菌株鉴定

2.1.1 降解菌株的菌落形态特征观察 降解菌在LBA培养基上生长良好，菌落生长较快，结构疏松，表面灰绿色，背面无色或略呈褐色（图1-D）。菌体有许多复杂的分枝菌丝构成（图1-A）。营养菌丝具有分隔；气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端产生烧瓶形或近球形顶囊（图1-C），表面产生许多小梗，小梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子（图1-B）。具典型的黄曲霉形态特征。

2.1.2 菌株 Z5序列测定 采用真菌鉴定通用引物ITS1/ITS4对该菌株进行rDNA-ITS的PCR扩增，经测序分析该菌株 ITS序列片段长 589bp （Genbank收录号为KT633952）。BLAST分析表明，该菌株的 rDNA-ITS序列与 GenBank中FJ878681、HQ340108、HQ340103、HQ340101等黄曲霉序列的相似性最高，达到99%。

图1　降解菌的菌落和形态学特征Fig.1 The colony and morphological characteristics of the acid-degrading bacterium

综合上述的形态学观察及ITS序列数据，将该降解菌初步鉴定为黄曲霉菌（Aspergillus flavus）。

2.2 菌株对苯甲酸降解的影响

2.2.1 不同浓度苯甲酸对菌株干重的影响 图 2可知，降解菌株在苯甲酸溶液中经过15 d培养后干重随浓度的增加呈先增大后降低的趋势。苯甲酸干重在T2处理中达到最大，为0.765 g，与其他处理差异显著；在T3、T4和T5处理浓度中干重显著降低，且3个处理间无显著性差异。

2.2.2 菌株对苯甲酸降解速率的影响 图3可知，降解菌在T1和T2处理浓度下苯甲酸的降解速率呈先上升后降低的趋势，在第9天时降解速率达到最大，分别为2.7和8.5 mg/d，然后逐渐降低，在第15 d时两个浓度处理下苯甲酸的降解速率趋于相同，分别为1.31和1.2 mg/d，其他处理浓度下基本不降解。

图2　不同浓度苯甲酸溶液对降解菌干重的影响Fig. 2 Effects of benzoic acid solution at different concentrations on dry weight of degrading bacteria

图3　降解菌对苯甲酸溶液降解速率的影响Fig. 3 Effect of degrading bacteria on the degration rate of benzoic acid

2.3 降解菌液对烤烟幼苗根系结构的影响

表1可知，各处理间以M1处理的烤烟幼苗根系生长最好，与M2和M3处理的各类根系结构指标有显著性差异；M2与M3处理除总根表面积有显著性差异，其他指标均无显著性差异，但M3处理烤烟根系生长优于M2处理。说明，根系分泌物中加入降解菌后能够在一定程度上降低根系分泌物对烤烟根系生长的抑制作用。

2.4 降解菌液对烤烟幼苗叶绿素含量的影响

表2可知，灌浇不同处理液后对烤烟幼苗生长过程中叶绿素含量的影响不同。其中，M1处理较M2和M3处理在叶绿素各类指标中均为最大，且差异性显著，M2和M3处理间虽无显著性差异，但M3处理叶绿素含量有高于M2处理的趋势。

2.5 降解菌液对烤烟幼苗光合特性的影响

表3可知，含有降解菌处理液的M3处理能够减缓根系分泌物对烤烟生长过程中光合特性的抑制作用。各处理间光合特性以 M1＞M2＞M3，M1处理与M2和M3处理间呈显著性差异，M2 和 M3处理的净光合速率呈显著性差异，但气孔导度、蒸腾速率以及胞间CO2浓度无差异或差异不显著。

表1　不同处理对烤烟幼苗根系结构的影响Table 1 Effects of different concentrations on flue-cured tobacco roots

表2　不同处理对烤烟幼苗叶绿素含量的影响 mg/gTable 2 Effects of different concentrations on flue-cured tobacco chlorophyll content

3　讨论

表3　不同处理对烤烟幼苗光合特性的影响Table 3 Effects of different concentrations on photosynthetic characteristics of flue-cured tobacco

烤烟根系分泌物造成的烤烟连作障碍是近年来我国主要植烟区遇到的常见问题，连作障碍往往会导致病虫害加重、土壤次生盐渍化及酸化、植物自毒作用和元素平衡破坏等［20］。Asao T等［21］认为导致烤烟连作障碍的一个重要原因是由于本身的自毒作用，由于连年种植，导致烤烟根系会分泌一些自毒物质并积累，达到一定程度会抑制烤烟生长。化感物质可以对受体植物的细胞分裂、膜功能、光合作用和生物合成等生理生化反应产生影响［22］。笔者从烤烟根系分泌物中分离出一株能够降解苯甲酸的菌株，采用形态学观察和rDNA-ITS的扩增及序列分析对其进行鉴定，初步将其鉴定为黄曲霉（aspergillus. flavus），并对其降解效果进行了研究。研究结果对解决当前植烟土壤连作障碍有一定的现实意义。

关于苯甲酸降解菌的研究并不多见，方艳芬等［23］采用富集培养法从废水中分离到能以苯甲酸为唯一碳源和能源的菌株LS01，在最适宜条件下，菌株的降解率能达到85%以上；蔡宝立等［24］用富集培养法从工业污水中分离出不动杆菌（Acinetobacter sp.）BJ1、无色杆菌（Achromobacter sp.）BY1、假单胞菌（Paesdomonas spp.）SJ1、SY1 和SH1等5株能够降解苯甲酸的微生物，在最适条件下BJ1菌株对苯甲酸的降解率达到98%以上。苯甲酸是多种芳香化合物生物代谢的中间产物，研究发现，好氧微生物降解苯甲酸主要通过邻位代谢途径、间位代谢途径［25］以及苯甲酰辅酶A和3-羟基苯甲酰辅酶A代谢途径［26］，分别将苯甲酸分解为生理反应各阶段中间物质。国内外未见黄曲霉具有这种降解特性的报道，其降解机理有待进一步研究。

黄曲霉（Aspergillus flavus）对苯甲酸的降解效果研究表明，黄曲霉在以苯甲酸为唯一碳源在800 μmol/L浓度时生长条件最佳，苯甲酸降解率可达19.98%，在第9天时降解速率最快。进一步将黄曲霉培养后与烤烟根系分泌物混合施加到育苗盘中进行烤烟幼苗培养，能减轻根系分泌物对烤烟幼苗根系结构、叶绿素含量以及光合特性等指标的抑制作用，说明根系分泌物中施加降解菌液一定程度上弱化根系分泌物对烤烟幼苗的化感效应。与本研究结果相似，胡春江等［27］研究发现，在土壤中施加微生物修复菌物可以有效减轻作物连作障碍。上述研究结果表明微生物降解作物自毒物质，有助于克服连作障碍。此外，本文只研究了一种降解菌液与烤烟根系分泌物混合对烤烟幼苗生长的影响，要解决大田烤烟连作障碍，还需进一步分离鉴定更多根系分泌物降解菌株并进行大田试验研究。

参考文献

［1］ 高欣欣，于会泳，张继光，等. 烤烟根系分泌物的分离鉴定及对种子萌发的影响［J］. 中国烟草科学，2012，33（3）：87-91.

［2］ 晋艳，杨宇虹，段玉琦，等. 烤烟轮作、连作对烟叶产量质量的影响［J］. 西南农业学报，2004，17（S1）：267-271.

［3］ 张继光，申国明，张久权，等. 烟草连作障碍研究进展［J］. 中国烟草科学，2011，32（3）：95-99.

［4］ 时鹏，张继光，王正旭，等. 烟草连作障碍的症状机理及防治措施［J］. 安徽农业科学，2011，39（1）：120-122.

［5］ 高欣欣. 烤烟根系分泌物成分鉴定与分析［D］. 北京：中国农业科学院，2012.

［6］ 吴文祥. 烟草自毒物质及其对根基土壤微生物影响的研究［D］. 福州：福建农林大学，2010.

［7］ 官会林，郭云周，张云峰，等. 绿肥轮作对植烟土壤酶活性与微生物量碳和有机碳的影响［J］. 生态环境学报，2010，19（10）：2366-2371.

［8］ 薛超群，奚家勤，王建伟，等. 腐殖酸用量对土壤微生物数量和烟叶香气品质的影响［J］. 烟草科技，2014（3）：71-75.

［9］ 李昱，何春梅，林新坚. 施用沸石、白云石对植烟土壤及烟叶品质的影响［J］. 烟草科技，2006（4）：50-54.

［10］ 刘红杰，习向银，刘朝科，等. 微生物菌剂对植烟连作土壤酶活性的影响［J］. 烟草科技，2011（5）：66-72.

［11］ 毛宁，薛泉宏，唐明. 2株放线菌对土壤中苯甲酸和对羟基苯甲酸的降解作用［J］. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2010，38（5）：143-148.

［12］ 苗艳芳. 苯甲酸类化合物的微生物降解研究［D］. 成都：四川大学，2003.

［13］ 周治，杨柳燕. 高效降解苯酚酵母菌筛选及其降解特性研究［J］. 南京大学学报：自然科学版，2001，37（6）：724-729.

［14］ Wang H C，Li W H，Chen Q Y，et al. A rapid microbioassay for discovery of antagonistic bacteria for Phytophthora parasitica var. nicotianae ［J］. Phytopathology，2012，102∶ 267-271.

［15］ Fang Z D. Research Methods for Plant Pathology ［M］. Beijing∶ Agricultural Publishing House，1998∶ 37，343-345．

［16］ 李鑫，王茂胜，石俊雄，等. 烤烟根系分泌物对烤烟幼苗生长及酶活性的影响［J］. 湖北农业科学，2013，52（19）：4698-4702.

［17］ Lee S B，Taylor J W. Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores ［M］//Innis M A，Glefand D H，Sninsky J J，et a1. A guide to methods and application. San Diego，New York∶ Academic Press，1990∶ 282-287．

［18］ Wang H C，Li W H，Wang M S，et al. First report of Botrytis cinerea causing gray mold of tobacco in Guizhou province of China ［J］. Plant dis.，2011，95（5）∶612.

［19］ 陈波. 紫外分光光度法测定调味品中苯甲酸［J］. 江苏农业科学，2012，40（7）：229-233.

［20］ 裴国平，王蒂，张俊莲. 马铃薯连作障碍产生的原因及防治措施［J］. 广东农业科学，2010（6）：30-32.

［21］ Asao T，Hasegawa K，Sueda Y，et al. Autotoxicity of root exudates from trao［J］. Sci. Hort，2003，97（3）∶ 389-396.

［22］ 张福锁，何龙云，罗庆云，等. 植物逆境生理生态学［M］. 北京，化学工业出版社，2004：24-27.

［23］ 方艳芬，黄应平，苏静，等. 苯甲酸和苯胺的微生物降解研究［J］. 环境科学与技术，2008，31（4）：68-71.

［24］ 蔡宝立，张富国，张心平，等. 苯甲酸类化合物的微生物降解研究［J］. 应用与环境生物学报，1998，4（3）：286-289.

［25］ Neidle E L，Hartnett C，Ornston L N，et al. Nucleotide sequences of Acinetobacter calcoaceticus benABC genes for benzoate 1，2-dioxygenase reveal evolutionary relationships among multicomponents oxygenases ［J］. J Bacteriol，1991，173∶ 5385-5395.

［26］ Altenschmidt U，Oswald B，Steiner E，et al. New aerobic benzoate oxidation pathway via benzoyl-coenzyme A and 3-hydroxybenzoyl-coenzyme A in a denitrifying Pseudomonas sp. ［J］. J Bacteriol，1993，175∶ 4851-4858.

［27］ 胡春江，薛德林，王书锦，等. 大豆连作障碍研究Ⅲ海洋放线菌MB-97促进连作大豆增产机理［J］. 应用生态学报，2003，13（9）：1095-1098.

Isolation and Identification of a Benzoic Acid-degrading Bacterium and Its Effect on Growth of Flue-cured Tobacco

LI Xin1，2，WANG Feng3，ZHOU Jiheng2*，LI Qiang2，SHAO Jianping4，ZHAO Jie4，WANG Ruibao4，XU Ji4，LI Yabing4，LI Chao4
（1. College of BIological Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2. College of Tobacco Research，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；3. Southwest of Guizhou Company，Xingyi，Guizhou 562400，China；4. Luoping County Branch of Qujing City，Luoping，Yunnan 655800，China）

Abstract:In order to reduce adverse effects of continuous cropping on yield and quality to some extent，as well as growth and development of flue-cured tobacco，the authors isolated a benzoic acid decompositon strain from the root exudate of tobacco by plate screening and shaker rescreening. The strain was identified as Aspergillus according to rDNA-ITS and sequence analysis，culture characteristics and morphological characteristics. The results showed that the strain could grow normally in the 0-800 μmol/L benzoic acid concentration range in 15 days. To certain extent the strain’s growth was constrained in the 800-1600 μmol/L benzoic acid concentration range. When using benzoic acid as the sole carbon source at the concentration of 800 μmol/L，dry weight and degradation rate of the strain reached the maximum on LBA medium. The dry weight of the strain was 0.765 g and the degradation rate was 19.98%. The degradation of the strain reached the highest rate which was 8.5 mg/d on the ninth day. To some extent，application of the degradation strain could reduce the the hazard of benzoic acid in root exudates of flue-cured tobacco. The degradation strain can reduce the toxic effect of root exudates in a pot experiment，it then can potentially be used to degrade the self poison substance to overcome the continuous cropping obstacle.

Keywords:flue-cured tobacco；benzoic acid-degrading bacterium；isolation and identification；continuous cropping obstacle

中图分类号：S345.72

文章编号：1007-5119（2016）01-0072-06

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.01.013

基金项目：中国烟草总公司项目“土壤微生物生态修复关键技术研究与应用”（11020100219）；湖南省研究生科研创新项目“基于烤烟土壤-根系互作机制的烟叶钾素调控技术研究”（CX2015B238）

作者简介：李 鑫（1989-），男，在读博士，研究方向：烟草生物科学与工程技术。E-mail：s2007203272@yeah.net*通信作者，E-mail：jhzhou2005@163.com

收稿日期：2015-06-22 修回日期：2015-11-04