四株鸭源H3N8亚型禽流感病毒对SPF鸡的感染性分析

崔鹏飞，彭　志，张　芳，关立峥，肖　丽，李莉莎，邓国华*，陈化兰*

(1.甘肃农业大学 动物医学院，兰州 730070；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨 150001)



四株鸭源H3N8亚型禽流感病毒对SPF鸡的感染性分析

崔鹏飞1，2，彭志2，张芳2，关立峥1，2，肖丽2，李莉莎2，邓国华2*，陈化兰1，2*

(1.甘肃农业大学 动物医学院，兰州 730070；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨 150001)

为评价鸭源H3N8亚型禽流感病毒对鸡的感染风险，作者选取了4株HA基因位于不同进化分支的病毒进行了SPF鸡的感染性试验。结果表明，这4株H3N8亚型禽流感病毒不需要提前适应就可以感染鸡，病毒对鸡不同脏器的组织嗜性存在较大差异。鸡感染病毒后未表现出明显的临床症状，大部分感染鸡可以通过呼吸道和消化道向外排毒。此外，DK/ZJ/S4088/2013和DK/GZ/S1245/2013这两株病毒还可以由感染组的鸡传播给接触组的鸡。综上所述，本研究中的4株鸭源H3N8亚型禽流感病毒具有感染鸡并在鸡群间传播的潜在风险，在家禽的饲养和流通环节中应尽量避免鸡群与鸭群的接触。

禽流感病毒；H3N8；鸡；感染性

H3N8亚型流感病毒宿主范围广泛，除了感染野鸟和家禽外，还可以感染马、犬、猫、猪、海豹、骆驼、驴等多种哺乳动物，并且跨物种传播的现象也时有发生[1-4]。近期禽流感监测数据表明H3亚型禽流感病毒是我国主要流行的低致病性禽流感病毒亚型之一，NA亚型以N2和N8亚型为主，其中H3N8亚型禽流感病毒主要从养殖场或者活禽市场的家鸭体内分离到并且该亚型病毒的分离数量具有逐年增多的趋势[5-7]。虽然H3N8亚型禽流感病毒很少在鸡体内分离到，但是之前已经有一些关于H3亚型禽流感病毒感染鸡的报道。2002年在意大利的患有中度呼吸道疾病的鸡体内分离到多株H3N2亚型禽流感病毒，该病毒可以在鸡的呼吸道内有效复制并引起鸡的产蛋量下降[8]。2006年至2007年期间，蒲娟等对我国18个省市地区的173个规模化养殖场进行了H3亚型禽流感病毒的血清学调查，结果在459份血清中共检测出141份样品为H3亚型禽流感病毒抗体阳性[9]。为评价H3N8亚型禽流感病毒对鸡群的感染风险，作者选择了4株HA基因位于不同进化分支的鸭源H3N8亚型禽流感病毒进行了SPF鸡的感染性试验。

1　 材料与方法

1.1毒株和实验动物

本研究用到的病毒包括A/duck/Guangdong/S1286/2009(H3N8)(简称DK/GD/S1286/2009)、A/duck/Hunan/S1674/2013(H3N8)(简称DK/HuN/S1674/2013)、A/duck/Zhejiang/S4088/2013(H3N8)(简称DK/ZJ/S4088/2013)、A/duck/Guizhou/S1245/2013(H3N8)(简称DK/GZ/S1245/2013)，这4株病毒均由国家禽流感参考实验室分离、鉴定并保存。4周龄SPF鸡和9～11日龄SPF鸡胚均由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.2主要试剂

病毒RNA提取试剂盒为北京天根生化有限公司产品；RNA酶抑制剂和M-MLV逆转录酶为Promega公司产品；rTaq DNA聚合酶为TaKaRa公司产品；胶回收试剂盒为Axygen公司产品；测序反应试剂盒BigDye Terminator 3.1为ABI公司产品。

1.3HA基因的进化分析

按照病毒RNA提取试剂盒说明书操作提取病毒的RNA，RT-PCR扩增病毒的HA基因，利用ABI公司的测序反应试剂盒BigDye Terminator 3.1进行HA基因序列测定。经DNAStar软件拼接后，利用MEGA 5.0软件绘制HA基因进化树。

1.4鸡胚半数感染量(EID50)测定

将种毒进行10倍倍比稀释，每个稀释度以0.1 mL·枚-1的剂量接种5枚9～11日龄的SPF鸡胚，37 ℃培养48 h后检测各稀释度血凝阳性鸡胚数目，根据Reed-Muench方法计算各病毒的EID50。

1.5病毒对SPF鸡的感染性试验

将病毒稀释至106EID50·100 μL-1，吸取100 μL稀释后的病毒液鼻腔感染11只4周龄的SPF鸡，感染24 h后放入2只未经感染的SPF鸡作为空白对照，以检测病毒的传播能力。感染3 d后，随机剖杀3只感染鸡，取脑、气管、胸腺、肝、脾、肾、胰腺、心、法氏囊、盲肠扁桃体和肺，利用鸡胚进行病毒滴定，以检测病毒在鸡各脏器的复制情况。在感染后第3、5和7天分别采集感染鸡和空白对照鸡的咽喉拭子和泄殖腔拭子，利用鸡胚进行病毒滴定，以检测鸡的排毒情况。感染后每天观察并记录鸡的临床表现，以评价病毒对鸡的致病性。在感染后第14天，采血分离血清，通过血凝抑制试验检测鸡的血清转阳情况。

2　结　果

2.1HA基因的遗传演化分析

如图1所示，本研究的4株H3N8亚型禽流感病毒的HA基因位于4个不同的进化分支，HA基因核苷酸相似性在88.2%～91.2%，氨基酸相似性在95.6%～97.4%。这4株病毒的HA蛋白裂解位点处氨基酸序列均为PEKQT↓RGL，仅具有一个碱性氨基酸，符合低致病性禽流感病毒的分子特征。HA蛋白第226位点和第228位点分别为谷氨酰胺(Q)和甘氨酸(G)，具有结合禽源受体的分子特征。潜在的N-糖基化位点符合以下分子特征：N-X-S/T(其中N为天冬酰胺，X为除了脯氨酸外的任意氨基酸，S为丝氨酸，T为苏氨酸)，本研究中的4株H3N8亚型禽流感病毒的HA均具有5个保守的潜在N-糖基化位点，分别为第22位的NGT，第38位的NAT，第165位的NVT，第285位的NGS，第483位的NGT。 此外，DK/GD/S1286/2009和DK/GZ/S1245/2013的HA蛋白在第6位还有一个潜在糖基化位点NDS，而DK/HuN/S1674/2013和DK/ZJ/S4088/2013的HA蛋白在第8位还有一个潜在糖基化位点NST。

2.2H3N8亚型禽流感病毒感染鸡的临床症状观察

在14 d的观察期内，所有鸡感染H3N8亚型禽流感病毒后均未出现死亡，也未表现出明显的临床症状，对鸡呈现低致病性，与其HA蛋白裂解位点处仅有一个碱性氨基酸的分子特征相一致。

图1　H3N8亚型AIV的HA基因进化树Fig.1　The phylogenetic tree of the HA gene of H3N8 viruses

2.3H3N8亚型禽流感病毒感染鸡的排毒检测

通过对感染后第3、5和7天的咽喉拭子和泄殖腔拭子进行滴定，发现鸡感染4株病毒后均可向外界排毒，但是排毒能力却有较大差异。其中鸡感染DK/HuN/S1674/2013后排毒能力较弱，虽然被感染的8只鸡中有7只鸡发生血清转阳，但是只检测到其中3只鸡在感染后第3天通过上呼吸道向外排毒。鸡感染DK/GD/S1286/2009、DK/ZJ/S4088/2013和DK/GZ/S1245/2013后排毒能力较强，并且感染后第3天以呼吸道排毒为主，在感染后第5 和7天则以消化道排毒为主(表1)。DK/GD/S1286/2009和DK/HuN/S1674/2013的接触组鸡未感染病毒，在咽喉拭子和泄殖腔拭子内未检测到病毒，血清也未转阳，表明这两株病毒不具备在鸡群间传播的能力。DK/ZJ/S4088/2013和DK/GZ/S1245/2013的2只接触组鸡中均有1只可通过咽喉和泄殖腔向外排毒，并且排毒鸡的血清也发生转阳，表明这两株病毒能够在鸡群间传播(表1)。

2.4H3N8亚型禽流感病毒感染鸡组织中的病毒载量

感染3 d后，随机剖杀3只感染组鸡，采集脑、气管、胸腺、肝、脾、肾、胰腺、心、法氏囊、盲肠扁桃体和肺进行病毒滴定。结果这4株病毒对鸡各脏器的组织嗜性存在较大差异，其中DK/HuN/S1674/2013感染组鸡的各个脏器内均未检测到病毒；DK/GD/S1286/2009感染组的3只鸡在气管、法氏囊和盲肠扁桃体内以及部分感染鸡的肺、胸腺和肾内可以检测到病毒。DK/ZJ/S4088/2013感染组只有1只鸡可以在胰腺、肾、法氏囊和盲肠扁桃体内检测到病毒。DK/GZ/S1245/2013感染组只有1只鸡可以在气管内检测到病毒(表2)。

3　讨　论

HA蛋白是流感病毒主要的表面抗原和保护性抗原，是一种多功能蛋白，与病毒的感染性、致病性、组织嗜性和宿主特异性密切相关[10-11]。为了评价H3N8亚型禽流感病毒对鸡的感染风险，作者选取了4株HA基因位于不同进化分支的鸭源H3N8亚型禽流感病毒进行相关试验。这4株病毒HA基因的核苷酸差异较大，相似性在88.2%～91.2%，HA蛋白氨基酸相似性在95.6%～97.4%，HA蛋白裂解位点处仅有一个碱性氨基酸，符合低致病性禽流感病毒的分子特征，鸡的感染性试验结果表明，鸡感染这4株H3N8亚型禽流感病毒后均未表现出明显的临床症状，与上述低致病性分子特征相一致。

虽然本研究中的4株H3N8亚型禽流感病毒可以感染鸡，但是在日常监测过程中该亚型的病毒主要分离自鸭群，这可能与当前我国家禽的饲养模式有关。当前我国鸡群主要是封闭式饲养，鸡群与外界接触的机会比较少；然而我国家鸭主要是开放式饲养，尤其是在水系发达的南方地区，家鸭与候鸟或者留鸟接触密切，而H3N8亚型禽流感病毒是野鸟主要携带的流感病毒亚型之一[12-15]，这就为H3N8亚型禽流感病毒在家鸭与野鸟之间的传播提供了机会。此外，有研究表明禽流感病毒NA蛋白的茎部缺失有利于病毒由水生家禽向陆生家禽的适应[16-17]，然而在所有作者分离的H3N8亚型禽流感病毒中均未发现NA蛋白茎部缺失，这可能也是限制H3N8亚型禽流感病毒在鸡群中流行的因素之一。

4　结　论

本研究中的4株鸭源H3N8亚型禽流感病毒不需要提前适应就可以直接感染鸡，并且大部分被感染的鸡可以通过呼吸道和消化道向外界排毒，DK/ZJ/S4088/2013和DK/GZ/S1245/2013这两株病毒还可以由感染组的鸡传播给接触组的鸡，具有在鸡群间流行的潜在风险。因此，在今后的禽流感监测过程中应密切关注H3N8亚型禽流感病毒的流行动态，在家禽的饲养和流通环节中也应尽量避免鸡群与鸭群的接触。

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(编辑白永平)

Infectivity of Four H3N8 Avian Influenza Viruses of Duck Origin in SPF Chickens

CUI Peng-fei1，2，PENG Zhi2，ZHANG Fang2，GUAN Li-zheng1，2，XIAO Li2，LI Li-sha2，DENG Guo-hua2*，CHEN Hua-lan1，2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China；2.AnimalInfluenzaLaboratoryofMinistryofAgriculture，StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology，HarbinVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150001，China)

In order to evaluate the infectious risk of H3N8 avian influenza viruses(AIV) of duck origin to chickens，four H3N8 AIV viruses withHAgenes belonged to different genotypes were selected to challenge SPF chickens.It was demonstrated that the four viruses could infect chickens without pre-adaptation，and the four viruses had different replication capacity in chicken’s organs.After challenge，there weren’t obvious clinical symptoms in chickens，and most challenged chickens could shed viruses through orpharyngeal and cloacal routes.In addition，DK/ZJ/S4088/2013 and DK/GZ/S1245/2013 could transmit from infected chickens to healthy contact chickens.In conclusion，the four duck H3N8 AIV viruses in this study posed the potential risk to infect chickens and even could transmit among chickens，and measures should be taken to avoid the contact between chickens and ducks in the breeding and circulation of poultry.

avian influenza viruses；H3N8；chicken；infectivity

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.016

2016-03-01

国家自然科学基金 (31572552)

崔鹏飞(1986-)，男，山东费县人，博士生，主要从事禽流感病毒生物学特性研究，E-mail：cpf8687@126.com

陈化兰，研究员，E-mail：chenhualan@caas.cn; 邓国华，研究员，E-mail：dgh1971@163.com

S852.659.5；S855.3

A

0366-6964(2016)06-1209-06