龙藤筋骨片中蛇床子素含量测定研究

汪 涛，赵雁平，胡卫东，李育芳，程 波（.解放军武汉疗养院药械科，湖北 武汉 430074；.华中科技大学同济医学院，湖北 武汉 430030）



龙藤筋骨片中蛇床子素含量测定研究

汪 涛1，赵雁平1，胡卫东1，李育芳1，程 波2（1.解放军武汉疗养院药械科，湖北 武汉 430074；2.华中科技大学同济医学院，湖北 武汉 430030）

[摘要]目的：建立龙藤筋骨片中蛇床子素的含量测定方法。方法：采用HPLC法测定龙藤筋骨片中蛇床子素的含量。选用welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；以乙腈-水（43∶57）为流动相；检测波长：330 nm；流速：1.5 mL·min-1；柱温：35 ℃。结果：HPLC法测定蛇床子素不存在干扰，蛇床子素进样量在1.560×10-3～0.046 8 mg·mL-1范围内时，线性关系良好（r = 0.999 9）；平均回收率为100.82%，RSD为1.68%。结论：HPLC法测定蛇床子素含量简便、稳定、可靠，可作为龙藤筋骨片中蛇床子素的质量控制方法。

[关键词]龙藤筋骨片；蛇床子素；含量测定；高效液相色谱法

龙藤筋骨片为解放军武汉疗养院配制的纯中药制剂，于1990年首次取得军队医疗机构制剂批准文号，至今已在临床使多年，2011年再次取得军队医疗机构制剂批准文号：广制字（2011）F03001。该制剂采中药粉末与中药提取浸膏混合后制粒，颗粒干燥后压片的方法制备，属于半浸膏素片；由中药独活、熟地、海桐皮、骨碎补、羌活、当归、牛膝组成[1]。独活为君药；熟地、海桐皮、骨碎补均为臣药；羌活、当归、牛膝均为佐药。诸药配伍，具有补肾活血、通络止痛、散寒除湿的功效，于治疗肥大性关节炎、骨质增生、腰椎间盘突出、坐骨神经痛、肩周炎、风湿性关节炎等症。为更好地控制产品质量，笔者采高效液相色谱法（HPLC）对龙藤筋骨片中所含蛇床子素进行了含量测定研究，为该制剂建立完善的质量标准提供参考。

1　仪器与试药

高效液相色谱仪（Dionex Ultimate3000，美国戴安公司）；色谱柱为welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）、Phenomenex Luna C18柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；LC-350A型超声波中药处理机（济宁市中区鲁超仪器厂）。

蛇床子素对照品（中国食品药品检定研究院，批号110822-201308）。龙藤筋骨片（批号150108、150305、150317）由解放军武汉疗养院提供。乙腈（色谱纯，美国Fisher公司，批号15035045）；水为纯净水；其余试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

2　蛇床子素含量测定[2]方法和结果

2.1溶液的制备

2.1.1供试品溶液 取龙藤筋骨片研碎，取粉末约1.0 g（批号150305），精密称定，置具塞锥形瓶内，精密加入甲醇20 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，冷却，再称定重量，甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.2对照品溶液 精密称取蛇床子素5.20 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液（0.052 0 mg ·mL-1）。再精密吸取对照品储备液3 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得溶液浓度为0.015 6 mg·mL-1。

2.1.3阴性对照溶液 取除去独活以外的其它药材，按确定的制备工艺生产阴性供试品。按拟订的供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。

2.2色谱条件与系统适用性实验

色谱柱为welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm）；以乙腈-水（43∶57）为流动相；检测波长：330 nm；流速：1.5 mL ·min-1；柱温为35 ℃。理论塔板数按蛇床子素峰计算应不得低于6000。

2.3专属性实验

将上述3种溶液各20 µL，按“2.2”项下方法分别进样分析，色谱图结果显示，蛇床子素出峰时间为21.86 min，色谱峰峰形对称，达到基线分离，阴性对照供试品溶液无干扰，表明该法专属性良好。详见图1。

2.4线性关系的考察

分别精密吸取对照品储备液（0.052 0 mg·mL-1）0.3、0.6、1.5、3.0、6.0、9.0 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得不同浓度的对照品溶液。分别精密吸取不同浓度的对照品溶液20 μL注入液相色谱仪中，测定峰面积，以质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为：Y = 7.467 1×102X + 0.034 1，r = 0.999 9。结果表明：蛇床子素对照品在1.560×10-3～0.046 8 mg·mL-1范围内，线性关系良好。

2.5仪器精密度实验

精密吸取同一供试品溶液（批号150305）重复进样6次，测定峰面积，RSD为0.30%。结果表明，本试验精密度良好。

2.6重复性实验

取同一批供试品（批号150305）6份，分别按“2.1.1”项下方法拟定制备，测定峰面积并计算含量，结果表明供试品中蛇床子素的平均含量为0.263 1 mg·g-1，RSD为1.16%。

2.7稳定性实验

取同一批供试品（批号150305），按“2.1.1”项下方法拟定制备，分别于配制后0、1、2、8、16、24 h进样测定，测定峰面积值的RSD为0.23%。结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8加样回收率实验

分别精密吸取对照品储备液（0.104 mg·mL-1）3、5、10 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得不同浓度的蛇床子素对照品溶液（浓度分别为3.12、5.20、10.40 μg ·mL-1）。再精密称取已知准确含量的同一批供试品（批号150305）共9份，分别精密加入上述不同浓度的蛇床子素对照品溶液20 mL，每个浓度制备3份，按拟订的供试品溶液制备方法制备，精密吸取20 µL注入高效液相色谱仪，按“2.2”项下色谱条件进行测定，结果显示蛇床子素的平均回收率为100.82%，RSD为1.68%，详见表1。

图1　HPLC色谱图A–对照品，B–供试品，C–阴性对照；1–蛇床子素Fig 1 HPLC chromatogramsA–reference substance, B–sample, C–negative reference substance; 1–osthole

2.9耐用性试验

分别精密称取同一批号（批号150305）的供试品粉末，按“2.1.1”项下方法制备，按照“2.2”项下色谱条件，采3种不同品牌的色谱柱，依法测定。结果显示：welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）：分离度 > 1.5，理论塔板数11 944，含量为0.263 1 mg·g-1；Phenomenex Luna C18柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）：分离度 > 1.5，理论塔板数9904，含量为0.267 1 mg· g-1；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）：分离度> 1.5，理论塔板数12 517，含量为0.267 7 mg·g-1，RSD为0.94%。表明3种不同品牌色谱柱均能重现现有方法。

2.10供试品的含量测定

取本品3批，批号分别为150108、150305、150317，按“2.2～2.4”项下方法进行实验。结果见表2。

表1　加样回收率实验结果. n = 9Tab 1 Results of recovery test. n = 9

表2　供试品中蛇床子素的含量测定结果Tab 2 Results of content determination of osthole in samples

3　讨论

龙藤筋骨片由7味中药材组成，方中独活味辛、苦，性微温，治风寒湿痹，腰膝酸痛，手脚挛痛，药理研究显示其具有扩张血管、减少渗出、镇痛抗关节炎等作[3]。羌活辛散祛风、味苦燥湿、能祛风散寒除湿，故善治腰以上风寒湿痹，尤以肩背肢节疼痛者佳。研究表明羌活能解热镇痛、抗炎、增加脑血流量、缓解疼痛和抗凝[4]。当归，以补血行气、舒筋活络、活血止痛[5]。研究显示，牛膝具有扩张下肢血管和改善血液黏度和微循环的作，从而起到消肿止痛的治疗作[6]。熟地以“填骨髓，长肌肉，生精血”，“通血脉，益气力”。研究显示，骨碎补具有促进骨折愈合和补肾强骨的功效[7-8]。诸药合，起到祛风除湿散寒、活血化瘀、通络镇痛、改善血液循环、消炎止痛的作。

3.1含量测定指标成分的选择

在建立龙藤筋骨片中有效成分含量测定方法的过程中，根据龙藤筋骨片所含7味药材所起作及量，分别对独活、熟地中的有效成分进行了含量测定实验。但是在实验过程中发现，龙藤筋骨片溶液中熟地所含毛蕊花糖苷HPLC色谱峰未达到基线分离、独活所含二氢欧山芹醇当归酸酯加样回收实验时存在干扰，均不能被作龙藤筋骨片的含量测定指标成分。

蛇床子素为独活有效成分之一，独活又为方中主药，并且含量测定及加样回收实验不存在干扰，故选择蛇床子素作为控制龙藤筋骨片质量的指标成分。

3.2流动相的选择

《中国药典》2015年版一部中独活项下测定蛇床子素，以乙腈-水（49∶51）为流动相，测定时发现供试品分离度差，经反复实验，选定乙腈-水（43∶57）为流动相进行测定，结果显示供试品溶液峰形较好，蛇床子素能够达到基线分离，理论塔板数按蛇床子素峰计算不低于6000。故最终采此流动相。

3.3蛇床子素含量限度的确定

由于《中国药典》2015年版一部中对独活中蛇床子素的含量有规定，根据实验情况，选择蛇床子素的含量为重点控制对象。根据含量测定的结果及大量配制中的实际情况，建议龙藤筋骨片应含蛇床子素≥70 µg·片-1。龙藤筋骨片的临床观察数据显示，其对患者血、尿常规、肝肾功能、心电图等方面检查均无不良影响，未发现异常变化。同时，在治疗前后也未发现因龙藤筋骨片引起的毒副作[9]。因此，我们认为该制剂在目前口服剂量、疗效范围内药安全。

[参考文献]

[1] 汪涛，胡卫东，李卫兴，等.龙藤筋骨片制备工艺研究[J].中国药业，2012，21（14）：59-61.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：通则0512.

[3] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海人民出版社，1977：1705.

[4] 马玉林，李建民，马莉，等.药植物羌活的研究进展[J].安徽农业科学，2010，38（24）：13092-13093.

[5] 汪涛，胡卫东，李卫兴，等.龙藤筋骨片的药效学实验研究[J].中国疗养医学，2013，22（2）：98-100.

[6] 李卫兴，李育芳，李清红，等.龙藤筋骨片治疗老年骨质增生性腰椎病疗效观察[J].华南国防医学杂志，2012，26（4）：328-330，371.

[7] 范婧蓉，韩博，李禹涛，等.骨碎补水提液对大鼠成骨细胞的影响[J].中国兽医杂志，2009，45（2）：13-15.

[8] 高颖，王新峦，王乃利，等.骨碎补中的化学成分[J].中国药物化学杂志，2008，18（4）：284-287.

[9] 李卫兴，李清红，陈立.龙藤筋骨片对肝肾功能影响的临床观察[J].华南国防医学杂志，2011，25（5）：450-451.

Study on content determination of osthole in Longtengjingu tablets

WANG Tao1, ZHAO Yan-ping1, HU Wei-dong1, LI Yu-fang1, CHENG Bo2(1. The Drug and Equipment Section of Wuhan Sanatorium of PLA, Wuhan 430074, China; 2. Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China)

[ABSTRACT]Objective: To establish a content determination method of osthole in Longtengjingu tablets. Methods：The content of osthole in Longtengjingu tablets were determined by HPLC. The analysis was performed on welch Ultimate AQ-C18column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm). The mobile phase was consisted of acetonitrile and water (43 : 57). The detection wavelength was 330 nm. The fow rate was 1.5 mL·min-1. The column temperature was 35 ℃. Results: There was no interference for osthole detection by HPLC method. The linear range of osthole was 1.560 × 10-3–0.046 8 mg·mL-1(r = 0.999 9). The average recovery was 100.82% (RSD = 1.68%). Conclusion: The method is simple, stable, reliable, and can be adopted as the quality control method of osthole.

[KEY WORDS]Longtengjingu tablets; Osthole; Content determination; HPLC

[中图分类号]R917

[文献标识码]A

[文章编号]1672–8157(2016)02–0089–03

[基金项目]军队医疗机构制剂标准提高计划项目（14TG0197）

[作者简介]汪涛，男，主管药师，研究方向：医院药学、中药制剂。E-mail：taidi1127@126.com

收稿日期：（2015-10-12 修回日期：2015-12-05）