甘草酸和甘草次酸对H9c2鼠心肌细胞活性氧水平的影响

郑　磊，付帮泽，解　华，常　宏，郭淑贞，王　伟

甘草酸和甘草次酸对H9c2鼠心肌细胞活性氧水平的影响

郑磊，付帮泽，解华，常宏，郭淑贞，王伟

北京中医药大学基础医学院(北京 100029)，E-mail：rami2011@163．com

摘要：目的探索甘草酸和甘草次酸对H9c2鼠心肌细胞的活性氧(ROS)水平的影响。方法实验对象是H9c2鼠心肌细胞。第一步通过3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)方法探索甘草酸和甘草次酸的毒性。第二步是用乙酰乙酸双氯荧光素(DCFH-DA)法，在激光共聚焦显微镜下检测活性氧水平。结果最大浓度10-1μg/μL甘草次酸具有显著的毒性(P<0．01)，各浓度甘草酸均无显著毒性。10-6～10-1μg/μL甘草酸、10-6～10-2μg/μL甘草次酸均具有显著的促增殖作用(P<0．01)。10-5mol/L血管紧张素Ⅱ可以显著升高细胞内活性氧水平(P<0．01)。10-6μg/μL甘草酸和甘草次酸均可以显著降低血管紧张素Ⅱ诱导的活性氧水平(P<0．01)，其作用强度与阳性对照夹竹桃素相近(P>0．05)。结论降低细胞内活性氧水平可能是甘草酸和甘草次酸缓解心衰的效应机制之一，而甘草酸和甘草次酸可能是甘草干预心衰的重要效应成分。

关键词：心衰；甘草酸；甘草次酸；活性氧；血管紧张素Ⅱ；心肌细胞

心力衰竭是冠心病、高血压、瓣膜病、心肌炎等多种心血管疾病的终末阶段，是世界性的医疗卫生难题。中国心血管病报告2014显示[1]，中国心血管病患病率处于持续上升阶段。目前，全国有心血管病病人约2．9亿，其中心力衰竭病人450万，人群慢性心力衰竭患病率为0．9%。氧化应激被认为是心力衰竭的重要发病机制之一，并可能成为心衰治疗的重要干预环节。经典的氧化应激被定义为活性氧(包括超氧自由基、过氧化氢、羟自由基等)的内源性生成和细胞内潜在的抗氧化能力(包括过氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还原蛋白等)之间的平衡破坏，而ROS参与了包括心肌细胞凋亡、成纤维细胞增生、胶原代谢平衡失调等多个导致心力衰竭的心室重构关键的病理进程[2]。甘草具有补脾益气、祛痰止咳、缓急止痛、清热解毒、调和诸药等功效，在心力衰竭的中医药治疗中应用广泛。其所含主要药理学活性物质是甘草酸(glycyrrhizic acid，GCA)及其盐，以及在体内主要的水解活性成分甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)和甘草黄酮等成分[3]。现代研究证实，甘草酸和甘草次酸都具有抗炎、免疫调节、抗病毒、保护肝细胞等作用[4-5]。课题组前期采用网络药理学方法分析发现，甘草酸和甘草次酸可能具有调节氧化应激的作用，本研究拟以H9c2大鼠心肌细胞为研究对象，探索甘草酸和甘草次酸对ROS的影响，初步揭示甘草在干预慢性心力衰竭中的效应成分及效应机制。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1细胞培养及传代胎牛血清(四季青，优级胎牛血清，100 mL，140628)，双抗生素(青霉素+链霉素)，谷氨酰胺，DMEM，胰酶，PBS磷酸盐缓冲液。96孔板(CosTAR，3599)，25 cm2培养瓶，激光共聚焦小皿。

1．1．2药品甘草酸(普菲德，批号：131201，HPLC≥98%)，甘草次酸(普菲德，批号：130611，HPLC≥98%)。DMSO(SIGMA，D2650，100 mL)，MTT(Sigma，Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide，M5655-500MG)。乙酰乙酸双氯荧光素(Invitrogen molecular probes，D99，1072945，DCFH-DA)，夹竹桃素(Santa cruz，sc-203321，APO)，血管紧张素Ⅱ(Sigma，A9525-10mg，SLBJ0358V，AngⅡ)。

1．1．3仪器培养箱(Thermo，3111，Forma Series Water Jacket) 37℃ 5% CO2。震荡器(Qilinbeier，TS-100)。酶标仪(KHB，ST-360)。激光共聚焦显微镜(OLYMPUS，FV1000)。倒置显微镜(OLYMPUS，CKX41SF)。

1．2H9c2鼠心肌细胞培养本研究所用H9c2鼠心肌细胞从北京协和医院购买，采用含10%胎牛血清的DMEM培养。

1．33-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法采用此方法探索甘草酸和甘草次酸的毒性与其对细胞生长的影响，用以协助确定甘草酸、甘草次酸干预ROS的最佳药物浓度。甘草酸和甘草次酸用DMSO溶解，制成0．1 mg/μL的储液。实验分组：空白组，DMSO溶剂对照组(DMSO终浓度为0．1%，等同于本实验所设计的最高药物浓度组的DMSO终浓度)以及不同浓度梯度的药物组。H9c2鼠心肌细胞培养至80%融合，以0．05%胰酶消化，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基重悬，以5 000个细胞/孔的密度种于96孔板上，细胞贴壁24 h之后更换为无血清DMEM培养液继续培养24 h。之后吸出培养液，加入含有不同浓度梯度的甘草酸和甘草次酸的无血清DMEM(储液倍比稀释所得)，使得DMEM内药物终浓度为10-6μg/μL～10-1μg/μL。48 h之后，吸出液体，加入100 μL含有MTT的无血清DMEM。在37℃下孵育4 h。小心的吸出液体，加入150 μL DMSO。振荡器上震荡15 min之后，在酶标仪上检测OD值。

1．4乙酰乙酸双氯荧光素(DCFH-DA)法

1．4．1血管紧张素Ⅱ诱导ROS升高模型用本方法探索不同浓度的Ang Ⅱ对细胞内ROS水平的影响，用于筛选和建立Ang Ⅱ诱导ROS升高的细胞模型。实验分组为：空白组、10-7～10-5mol/L Ang Ⅱ模型组。选取对数生长期的H9c2心肌细胞，用含10%胎牛血清的DMEM悬浮，密度为50 000个/mL。接种1 mL于直径20 mm的激光共聚焦小皿中。培养24 h之后，更换为无血清DMEM。再培养24 h之后，于模型组内加入(10-7～10-5)mol/L Ang Ⅱ。培养24 h之后，用乙酰乙酸双氯荧光素(DCFH-DA)法测定H9c2心肌细胞内活性氧水平：1 mL PBS冲洗2遍H9c2心肌细胞，加入DCFH-DA 10 μmol/L，每皿加100 μL，37 ℃孵育30 min，再用PBS冲洗2遍。在激光共聚焦显微镜下随机选取5个不重复区域进行摄片，用ImageJ1．48软件分析5个视野绿色荧光强度的平均值，再对每组的样本进行统计学分析。

1．4．2药物对血管紧张素Ⅱ模型的影响用本方法探索甘草酸和甘草次酸对Ang Ⅱ建立的ROS模型的影响。实验分组：空白组、Ang Ⅱ模型组、甘草酸组(血管紧张素Ⅱ+甘草酸)、甘草次酸组(血管紧张素Ⅱ+甘草次酸)、阳性对照组(血管紧张素Ⅱ+夹竹桃素)。培养24 h之后，更换为无血清DMEM。再培养24 h之后，阳性对照组加入夹竹桃素100 μmol/L，培养箱内孵育30 min。之后，所有样品用PBS冲洗2遍。模型组加入含Ang Ⅱ的无血清DMEM，药物组加入含Ang Ⅱ和甘草酸或甘草次酸的无血清DMEM(药物浓度参考MTT法的结果确定)，空白组加入无血清DMEM。培养24 h之后，用乙酰乙酸双氯荧光素(DCFH-DA)法测定H9c2心肌细胞内活性氧水平。

2结果

2．1甘草酸、甘草次酸的细胞毒性和促增殖作用

2．1．1甘草酸的细胞毒性对比空白对照组和溶剂对照组的数据，可以发现0．1%浓度的DMSO，无明显的细胞毒性(P>0．05)；甘草酸在本实验的最高浓度(0．1 μg/μL)及其他稀释浓度，均未发现有明显的毒性。

2．1．2甘草酸对细胞的促增殖作用甘草酸在10-6～10-1μg/μL的浓度，有明显促增殖作用(P<0．01)，不同浓度间无统计学意义 (P>0．05)。10-9～10-7μg/μL甘草酸组OD值与对照组无统计学意义(P>0．05)。详见图1。

与空白对照组比较，1)P<0．01。

2．1．3甘草次酸的细胞毒性对比空白对照组和溶剂对照组数据，可以发现1‰浓度DMSO，无明显细胞毒性(P>0．05)。0．1 μg/μL甘草次酸组OD值显著低于空白及溶剂对照组(P<0．01)，表明该浓度具细胞毒性，其余稀释浓度未见到有明显的毒性。

2．1．4甘草次酸的促增殖作用在10-5μg/μL～10-2

μg/μL的浓度区间，OD值均显著高于空白对照组(P<0．01)，10-6μg/μL甘草次酸OD值显著高于空白对照组(P<0．05)，提示甘草次酸在10-6～10-2μg/μL的浓度范围内具有一定的促增殖作用，而且各浓度组间无统计学意义(P>0．05)。10-9～10-7μg/μL甘草次酸组OD值与空白对照组比无统计学意义(P>0．05)。详见图2。

与空白对照组比较，1)P<0．05，2)P<0．01。

图2MTT法检测甘草次酸的细胞毒性及促增殖作用

2．2甘草酸、甘草次酸对血管紧张素Ⅱ诱导的H9c2鼠心肌细胞活性氧的影响

2．2．1不同浓度的血管紧张素Ⅱ对H9c2鼠心肌细胞活性氧的影响与空白对照组相比，10-5mol/L Ang Ⅱ组可以显著的升高细胞内ROS水平(P<0．01)，而10-6mol/L、10-7mol/L Ang Ⅱ组对ROS无显著影响(P>0．05)。详见图3、图4。

图3　不同浓度的Ang Ⅱ对H9c2鼠心肌细胞活性氧的影响(共聚焦图片)

与空白对照组比较，1)P<0．05。

图4 Ang Ⅱ诱导ROS升高的模型探索

2．2．2甘草酸、甘草次酸对血管紧张素Ⅱ诱导的H9c2鼠心肌细胞活性氧的影响与空白对照组相比，Ang Ⅱ可以显著升高细胞内ROS水平(P<0．01)；与AngⅡ造模组相比，甘草酸、甘草次酸可以显著降低

细胞内ROS水平(P<0．01)，作用与阳性对照夹竹桃素组相近(P>0．05)。表明甘草酸和甘草次酸均可以显著的降低Ang Ⅱ诱导的细胞内ROS水平。详见图5、图6。

图5　甘草酸、甘草次酸对Ang Ⅱ诱导的H9c2鼠心肌细胞活性氧的影响(共聚焦图片)

与空白对照组比较，1)P<0．01；与模型组比较，2)P<0．01。

3讨论

本研究以H9c2细胞为研究载体，未发现甘草酸具有明显的毒性，同剂量的甘草次酸毒性却很明显。这与李锦[6]、曹珊[7]分别在基因毒性和小鼠口服所得的结论基本一致。甘草次酸为甘草酸类药物经过体内代谢的产物，是甘草酸类药物的真正药用成分。健康人长期大量服用甘草次酸能引起血压增高、水钠潴留和钾离子的排出，尿内钠/钾的比例稍有降低，这种作用与醛固酮相似[5]。正是由于甘草次酸在临床上的毒副反应限制了其在市场和临床上的广泛应用，在使用的过程中必须同时充分考虑其安全范围。

根据毒性试验的数据，发现甘草酸和甘草次酸在10-6μg/μL时具有促增殖作用的最低浓度，且与其他较高剂量组无统计学意义，可能是甘草酸、甘草次酸发挥心肌细胞保护作用的最低剂量，因此选择10-6μg/μL作为活性氧检测的给药浓度。

心脏是机体摄氧率最高的器官，抗氧化能力差，自由基容易损害心肌细胞。研究发现心力衰竭病人血浆和心包液中氧自由基增多，且氧自由基与心力衰竭的严重程度成正比[8]。ROS的功能可作为第二信使参与多种氧化还原信号通路的调节，在细胞生长分化、血管形成和血管紧张度的调控等方面起着重要作用，但是ROS的大量堆积可促发细胞氧化应激、钙超载、能量耗竭，并启动细胞凋亡和坏死[9]，降低ROS水平被认为是干预心力衰竭的新策略，但以ROS清除为手段的抗氧化治疗方案，因在大规模临床试验中不能降低，甚或增加了损害而遭到严重质疑[10]。因此，特异性抑制ROS相关的氧化酶及其通路是目前的研究热点。

NADPH氧化酶活性增加是终末期心衰病人心脏氧化应激最重要的来源之一。Ang Ⅱ是一类强效的NADPH氧化酶激活剂，通过刺激AT1R作用于NADPH氧化酶使体内血管ROS升高。Ang Ⅱ可通过ROS诱导由CaMKⅡ通路介导的心脏衰竭[11]。本实验表明，10-5mol/L的AngⅡ可以显著升高H9c2心肌细胞ROS水平。同时，发现10-6μg/μL甘草酸和甘草次酸均可显著的降低，由Ang Ⅱ诱导的细胞内ROS水平的升高。抑制心肌细胞内过度的氧化应激可能是甘草干预心衰的主要效应环节之一，而甘草酸和甘草次酸均可能是甘草调控氧化应激的重要效应成分。

借鉴网络药理学的研究方法初步发现，甘草酸、甘草次酸的抗氧化作用可能与特异性抑制NADPH氧化酶的活性有关。为了进一步阐明甘草酸和甘草次酸作用的关键氧化酶或通路，需要进一步的细胞实验分析及动物实验佐证，进而为开发特异性的抗氧化药物用于心衰的治疗提供实验依据。

参考文献：

[1]陈伟伟，高润霖，刘力生，等．《中国心血管病报告2014》概要[J]．中国循环杂志，2015，30(7)：617-622．

[2]Octavia Y， Brunner-La Rocca，Moens．NADPH oxidase-dependent oxidative stress in the failing heart： from pathogenic roles to therapeutic approach[J]．Free Radical Biology & Medicine，2012，52：291-297．

[3]Kim DH，Lee SW，Han MJ，et al．Biotransformation of glycyrrhizin to 18-beta-glycyrrhetinic acid-3-O-beta-D-glucuronide by Strepto-coccusLJ-22，a human intestinal bacterium[J]．Biol Pharm Bull，1999，22(3)： 320-322．

[4]韩瑶聃，王彬，王政雨，等．甘草酸药理作用的研究进展[J]．中国新药杂志，2012，21(21)：2499-2505．

[5]金敏，吴红金．甘草次酸药理作用的研究进展[J]．医学综述，2009，15(11)：1712-1715．

[6]李锦．甘草酸单铵盐的基因毒性[J]．现代药物与临床，2009，24(5)：314．

[7]曹珊．口服甘草次酸急性毒性、体内分布及对血清离子元素含量影响的研究[D]．哈尔滨：东北林业大学，2012．

[8]Michael M，Givertz MD，Douglas B，et al．Antioxidants and myocardial contractility illuminating the “dark side”of β-adrenergic receptor activation[J]．Circulation，2001，103： 782．

[9]Zhang YS，He L，Liu B，et al．A novel pathway of NADPH oxidase /vascular peroxidase 1 in mediating oxidative injury following ischemia-reperfusion[J]．Basic Res Cardiol，2012，107(3)：1-19．

[10]Bjelakovic G，Nikolova D，Gluud LL， et al．，Mortality in randomized trials of antioxidant supplements for primary and secondary prevention： systematic review and meta-analysis[J]．the Journal of the American Medical Association，2007，297(8)： 842-857．

[11]文海若，李波，付研．血管紧张素在心血管疾病中的氧化应激调节机制[J]．中国医刊，2014，49(2)：122-124．

(本文编辑王雅洁)

Effects of Glycyrrhizic Acid and Glycyrrhetinic Acid on the Levels of Reactive Oxygen Species in H9c2 Cell Line

Zheng Lei，Fu Bangze，Xie Hua，Chang Hong，Guo Shuzhen，Wang Wei

School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China

Abstract：ObjectiveThis research was to find the effect of glycyrrhizic acid(GCA) and glycyrrhetinic acid(GA) on reactive oxygen species(ROS) in H9c2 cell line． MethodsThe experimental subject was H9c2 cell line． First，the toxicity of GCA and GA were explored by MTT． Second，the ROS level under laser scanning confocal microscope was tested by DCFH-DA． ResultsThe toxicity of GA was found in the maximum concentration (10-1μg/μL)． The toxicity of GCA was not found in all the concentration ranges． Both of the drugs were able to improve the growth of the cell line in certain concentration ranges (GCA：10-6μg/μL to 10-1μg/μL，GA：10-6μg/μL to 10-2μg/μL) (P<0．01)． We can find that the ROS level was increased by 10-5mol/L angiotensin Ⅱ(P<0．01)． In the concentration of 10-6μg/μL，GCA and GA were able to decrease the ROS，rising by angiotensin Ⅱ to control group level(P>0．05)． The effect of GCA and GA were similar with the Apocynin(P>0．05)． ConclusionGCA and GA relieve the heart failure，which may depend on the decreasing of ROS level． GCA and GA may be the essential ingredients of glycyrrhiza in the intervention for heart failure．

Key words：heart failure；glycyrrhizic acid；glycyrrhetinic acid；reactive oxygen species；angiotensin Ⅱ；cardiom yocytes

基金项目：国家自然科学基金青年项目(No.81403319)；重大新药创制专项(No.2012ZX09103201-011)；教育部新世纪优秀人才支持计划(No.NCEF-13-0692)；北京中医药大学杰出青年人才项目(No.2015-JYB-XYQ002)

通讯作者：郭淑贞，E-mail：guoshz@bucm．edu.cn

中图分类号：R541R285

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．01．005

文章编号：1672-1349(2016)01-0021-05

Corresponding Author：Guo Shuzhen

(收稿日期：2015-09-28)

·基础医学论著·