细胞蜡块宫颈液基细胞P16在检测宫颈肿瘤中的作用

刘镜文　陈莉　吴秋良



细胞蜡块宫颈液基细胞P16在检测宫颈肿瘤中的作用

刘镜文1陈莉2吴秋良3

［摘要］目的探讨细胞蜡块P16检测在宫颈液基细胞学中的应用价值。方法采用标准化病人（standardized patient，SP）免疫组织化学的方法对180例细胞学标本进行P16检测。结果P16在未见上皮内病变细胞（negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM）、未明确诊断意义的非典型鳞状上皮细胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASC⁃US）、不除外高度病变的非典型鳞状上皮细胞（atypical squamous cells，cannot exclude a high⁃grade squamous intraepithelial lesion，ASC⁃H）、低度鳞状上皮内病变（low⁃grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）、高度鳞状上皮内病变（high⁃grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）和鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）中的阳性率分别为0%、5.63%、60.00%、30.23%、100.00%和100.00%。在180例患者中，只有73例有组织活检的结果，其中P16阳性的为48例，宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）CINII级及以上病变患者为33例；P16阴性的有25例，无CINII级及以上病变。结论利用细胞蜡块P16免疫组织化学染色，显示P16的表达与宫颈癌的发生和发展相关，因此可用于宫颈癌的病变分级，也可作为辅助诊断指标应用于宫颈病变的筛查。

［关键词］宫颈肿瘤；液基细胞学；免疫组织化学；细胞蜡块；P16

作者单位：1.广东省惠州市第一妇幼保健院病理科，广东，惠州516000
2.广东省东莞市虎门医院妇产科，广东，东莞523900
3.广东省广州市中山大学肿瘤防治中心病理科，广东，广州510060

液基细胞学检测相比较传统的巴氏涂片法，具有细胞结构清晰、背景干净的优点，但由于人工阅片，受人为因素制约，同时常常存在不明确意义的非典型鳞状上皮细胞等不明确的诊断，所以存在一定的假阳性和漏诊率［1］。目前主张实行联合筛查方案，即人乳头瘤病毒（human papillomaviruses，HPV）检测及液基细胞学检测同时应用进行宫颈癌的筛查。HPV是引起宫颈癌和癌前病变的主要原因，HPV通过合成一系列致癌蛋白干扰正常的细胞调控，如致癌蛋白E7引起的细胞周期调节蛋白PRb功能失活，破坏了PRb与肿瘤抑制因子P16之间的反馈环，使P16的特异性过度表达，从而导致细胞增生异常、遗传变异和转化。P16基因是继P53之后后发现的另一个抑癌基因，目前认为P16的抑癌作用较P53更为直接［2］。该基因的失调可导致细胞可无限制地扩增、生长，从而最终向肿瘤细胞转化。国内外大量研究表明：在正常宫颈组织中，P16蛋白表达为阴性，而在宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）CINI、CINII、CINIII、浸润癌组均有表达，且随着病变组织学分级的增加，阳性表达率及染色强度呈升高趋势［3］。目前该基因大量应用于宫颈活检组织中，用于鉴别宫颈上皮病变及萎缩等良性病变。本研究结合细胞蜡块的技术方法，旨在探讨P16蛋白表达的指标作为宫颈液基细胞学筛查辅助的可行性。

1　资料与方法

1.1一般资料

选择2013年11月至2014年11月期间在广东省惠州市第一妇幼保健院门诊就诊的180例宫颈病变患者，用一次性标本采集刷在宫颈口旋转采集，将刷头放入装有10 mL固定保存液的小瓶中。经TIB⁃AutoPrep1800沉降式全自动液基薄层细胞制片染色系统程序化处理，制成直径为1 cm的液集薄层细胞涂片。上述病变经宫颈细胞学诊断为非典型鳞状细胞（atypical squamous cells，ASC）及以上病变，或经免疫细胞学诊断为鳞状上皮内病变（squamous intraepithelial lesion，SIL）及炎症，均通过病理医师采用美国Cytic公司的thingpath2000技术，巴氏染色，并按照2001年版Bethesda分级系统（the Bethesda system，TBS）诊断为标准确诊。上述诊断结果由2位高年资病理医师双盲复诊阅片，并做出一致的诊断。SIL指子宫内皮在增生过程中出现的异常上皮细胞增长。患者年龄为22岁～63岁，平均年龄为（40±4）岁。所有病例均无宫颈锥切和子宫切除史及其他慢性消耗性疾病。

1.2方法

1.2.1宫颈细胞学收集方法

采用Thinprep液集基细胞学检测法（thinprep cytologic test，TCT），用专用细胞刷采集宫颈上皮细胞刷入TCT保存液，经Thinprep2000系统，制成直径为1 cm的薄层细胞学涂片，95%酒精固定，巴氏染色。

1.2.2细胞学诊断

用ThinPrep液基薄层细胞学检测系统来筛查宫颈病变，由细胞学专职人员阅片，采用TBS诊断分级系统（2001年修订）［4］。

1.2.3 P16免疫组化检测

先收集脱落细胞，利用离心沉淀、蛋白固定的方法，使细胞成块，经过脱水、包埋程序制作成片，用宫颈HELA细胞作为阳性对照，采用的P16抗体来自福州迈新生物技术开发有限公司。在光学显微镜下对涂片染色进行评估。光镜下P16阳性物质位于细胞核内和（或）细胞质中，以细胞核或者细胞质染成粉色或棕黑色为阳性。根据异型细胞是否着色和着色细胞数来判断P16蛋白的表达：1张涂片中至少5个异型细胞显示胞核着色（不伴或伴有包浆着色）判读为阳性；异型细胞主要表现在核浆比增大，胞核占整个细胞大小的一半以上；染色质异常，胞核淡染或深染，染色质分布不均成块状或颗粒状；胞核形状不规则，呈锯齿状或有较大凸起或凹陷；细胞聚集排列成条索状、片状，大小、形态不一。反之，着色的异型细胞数少于5个或没有异型细胞着色判读为阴性。

1.3统计学方法

2　结果

2.1TBS分类结果

按TBS分类，可将所采集的180例细胞学标本分为6大类：未见上皮内病变细胞（negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM）21例、未明确诊断意义的非典型鳞状上皮细胞（atypicalsquamous cell of undetermined significance，ASC⁃US）71例、不除外高度病变的非典型鳞状上皮细胞（atypical squamous cells，cannot exclude a high⁃grade squamous intraepithelial lesion，ASC⁃H）5例、低度鳞状上皮内病变（low⁃grade squamous intraepi⁃thelial lesion，LSIL）43例、高度鳞状上皮内病变（high⁃grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）38例和鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）2例（图1至图4）。

2.2宫颈脱落细胞中P16的表达

免疫组化实验后光学显微镜下对涂片染色进行评估，结果显示在NILM、ASC⁃US、ASC⁃H、LSIL、HSIL和SCC中的阳性率分别为0、5.63%、60.00%、30.23%、100.00%和100.00%（表1）。P16 在HSIL中的阳性表达率达到100.00%，远大于其在LSIL中的阳性表达率30.23%，两者差异有统计学意义（P=0.00 756〈0.01）。ASC⁃H的阳性率明显高于ASC⁃US组（P=0.000 342〈0.01）。ASC和LSIL细胞着色明显弱于HSIL，P16在LSIL中散在阳性，而在HSIL中弥漫表达，且在胞核和胞质均着色，染色强度也随着宫颈病变程度的加重而增强，表达强度与病变级别呈正相关。

表1　宫颈脱落细胞中P16的表达情况（n，%）Table 1 The expression of P16 in cervical cells（n，%）

2.3组织学与细胞学标本诊断的比较

在180例宫颈液基细胞学涂片中，只有73例有组织活检的结果，其中液基细胞学涂片免疫组化染色P16蛋白阳性的为48例，其中33例组织学检测结果为CINII级及以上病变；P16阴性的有25例，无CINII级及以上病变。

而这73例有组织活检的结果中：液基细胞学诊断为ASC⁃US而组织学诊断为CINII级及以上病变的有8例，其中6例可见P16蛋白阳性染色的异型细胞；液基细胞学诊断为LSIL而组织学诊断为CINII级及以上病变的有13例，其中7例为非典型细胞P16蛋白阳性染色；液基细胞学诊断为ASC⁃H，而组织学诊断为CINII级及以上病变的有5例，其中3例可见P16蛋白阳性染色，余2例P16蛋白染色为阴性；细胞诊断为HSIL组织学诊断为CINII级及以上的病变5例，其中2例可见P16蛋白染色的异型细胞；液基细胞学诊断为SCC组织学诊断为CINII级及以上病变为2例，具体结果见表2。

表2　P16阳性病例的细胞学和组织学诊断对比Table 2 The comparison of detection on P16 in positive cases by cytology and histology

3　讨论

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第2位，仅次于乳腺癌［5-6］。据世界范围统计，每年估计有46.6万的宫颈癌新发病例，其中80%发生在资源欠缺的发展中国家，其中亚洲占23.5万，中国估计有近10万新发病例，约占世界新发病例总数的1/5［7］。需要指出的是，每年新发的近50万宫颈癌病例还只是冰山一角，据估计全球宫颈癌高度癌前病变的妇女有1 000万例，低度子宫颈病变的有3 000万例［7］。我国大部分城市妇女由于缺乏有组织的筛查计划和医学知识，同样也面临着宫颈癌的严重威胁。特别是我国中西部农村，由于缺乏资金和医疗技术，宫颈癌是妇女的主要卫生问题之一。我国每年约有3万名妇女死于宫颈癌［8］。目前我国花了大量的人力物力进行宫颈癌的筛查，我们东莞市从2012年开始也由政府出巨资免费为35岁～59岁的适龄妇女进行宫颈癌和乳腺癌的筛查，但是，目前的筛查方案确诊一个宫颈癌的患者需要做4个检查，3次取材，确诊周期较长，共需要检查费用1 000多元，因此探讨宫颈癌筛查的更佳方案显得尤为重要。

研究发现，P16在CIN和宫颈癌中过量表达，更有实验证明随着病变加重P16的表达呈动态变化［8］。近年来关于多种癌抑制基因的研究表明，P16INK4A基因参加细胞周期调控，与肿瘤形成和发展直接相关，所以认为P16蛋白表达虽然尚不能替代高危型人乳头状瘤病毒检测，但仍可作为宫颈癌病变程度的指标，为筛查和预后治疗提供依据［9-10］。它作为辅助的生物学标志物，检测方法简单、易于操作、且费用较低，具有广阔的应用前景［11］。

本文利用细胞蜡块及免疫组化技术的优势，检测宫颈液基薄层细胞学阳性标本中P16蛋白的表达，行P16检测的同时，患者仍然按目前宫颈癌筛查步骤进一步检测、确诊。由本文实验结果可见，从ASC⁃UC到HSIL的各级别病变中，P16的阳性率逐步增高，在ASC⁃H和HSIL的阳性表达率极高，且大多呈强阳性的表达，P16的着色强度随病变的严重度而递增，而ASC⁃H和HSIL多为弥漫整片细胞表达，且在胞核和胞质均着色，染色强度也随着宫颈病变程度的加重而增强，可见P16蛋白的表达与CINII级及以上病变具有较高的相关性，即将P16蛋白的表达指标作为宫颈液基细胞学筛查辅助具有一定的可行性。因此显示出P16可以辅助宫颈病变的分级诊断，从而使不同医师的诊断有一致性，为临床提供更可靠的依据，而且通过上述结果更证实了P16对宫颈癌前的高度病变和宫颈癌有较高的敏感性。该技术的应用让病理医生能获取更多的诊断信息，特别对于基层医院病理医生较少的单位尤其适用［12］。另外，细胞块切片可以清晰见到组织碎片，可以帮助判断宫颈病变的严重程度。因此，我们认为其预测结果与宫颈活检这个金标准来对比，判断该预测结果的可靠程度，可以作为宫颈癌筛查的辅助诊断指标。

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The dectection of P16 in cervical tumor saved in wax block by cervical fluid cytology

LIU Jingwen1，CHEN Li2，WU Qiuliang3
（1. Department of Pathology，the First Maternal and Child Health Hospital of Huizhou，Huizhou，Guangdong，China，516000；2. Department of Obstetrics and Gynecology，Humen Hospital，Dongguan，Guangdong，China，523900；3. Department of Cancer Prevention and Control，Sun Yat⁃Sen university，Guangzhou，Guangdong，China，510060）

［ABSTRACT］Objective To evaluate the significance of the expression of P16 in cellular wax block liquid based cytology of cervical screening. Methods Standardized patient (SP) immunohistochemistry detection of protein P16 was performed on 180 specimens. Results The positive rates of P16 in negative for intraepithelial lesion or malignancy (NILM), atypical squamous cell of undetermined significance (ASC⁃US), atypical squamous cells, cannot exclude a high⁃grade squamous intraepithelial lesion (ASC⁃H), low⁃grade squamous intraepithelial lesion(LSIL), high⁃grade squamous intraepithelial lesion (HSIL) and squamous cell carcinoma (SCC) were 0%、5.63%、60.00%、30.23%、100.00% and 100.00%, respectively. There were only 73 patients who received the results of the biopsy, including 48 positive cases of P16 [with 33 cases of cervical intraepithelial neoplasiaⅡ(CINⅡ) or above] and 15 negative cases of P16 (with no CINⅡor above). Conclusion Cellular wax block P16 immunohistochemistry staining revealed that the expression of P16 protein was connected with the occurrence and development of cervical cancer, which may be used in the lesion classification of cervical cancer, and used as the auxiliary diagnostic indexes in the screening of cervical lesions.

［KEY WORDS］Cervical tumor；Liquid based cytology；Immunohistochemistry；Cellular wax block；P16

通讯作者：刘镜文，E⁃mail：6615151@qq.com