香菇菌糠纤维素酶的提取工艺优化

范 东，刘世操，祝爱侠,2*，陈 帆

(1.武汉轻工大学 动物营养与饲料安全湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430023；2.武汉轻工大学 畜禽饲料工程技术研究中心，湖北 武汉 430023)



香菇菌糠纤维素酶的提取工艺优化

范 东1，刘世操1，祝爱侠1,2*，陈 帆1

(1.武汉轻工大学 动物营养与饲料安全湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430023；2.武汉轻工大学 畜禽饲料工程技术研究中心，湖北 武汉 430023)

摘要：以香菇菌糠为原料，采用超声浸提法制备纤维素粗酶液，通过单因素试验和响应面设计，分析了超声功率、超声时间和液料比等因素对纤维素酶浸提的影响。结果表明，香菇菌糠纤维素酶最佳提取工艺为：超声功率500 W，超声时间15 min，液料比为20∶1，在此条件下的CMC酶活力为9.61 IU/g。

关键词：香菇菌糠；纤维素酶；超声波浸提法；响应面分析

香菇菌糠是指香菇子实体采摘后剩余的废弃培养基，其中含有大量的菌丝蛋白、多糖、纤维素酶等活性物质[1]。我国作为香菇大国，每年产生大量的菌糠是显而易见的，只有一部分会被运用到饲料、燃料和饵料之上，绝大部分菌糠被丢弃而白白浪费，这样不仅造成资源的浪费，而且还会严重污染环境[2-5]。为了促进香菇行业的良性发展、为香菇行业创造收入，高效地开发提取香菇菌糠中的纤维素酶是有效利用的关键。

纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称[6]。废弃香菇菌糠中的菌丝体中含有丰富的纤维素酶。如果能够把菌丝体中的纤维素酶提取出来，并制成酶制剂再添加到菌糠饲料生产中，有利于香菇菌糠的循环利用，更能降低纤维素酶的成本，提高饲料的营养和经济价值，而且生产出来的饲料可以替代部分粮食，从而缓解粮食短缺的问题。因此，本研究以香菇菌糠为原料，采用超声浸提法，通过单因素试验和响应面分析优化香菇菌糠中纤维素酶的提取工艺，以期为香菇菌糠中纤维素酶的回收利用提供参考。

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1试验材料香菇菌糠来源于武汉新洲徐古镇天添食用菌生产基地。酒石酸钾钠、3，5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、重蒸酚、无水亚硫酸钠、CH3COONa·3H2O、冰醋酸、羧甲基纤维素钠、葡萄糖等均为市售。

1.1.2试验仪器微型粉碎机、数显式恒温水浴锅、SHA-C恒温水浴振荡器、751分光光度计、TG16-W台式高速离心机、分析天平。

1.2试验方法

1.2.1纤维素酶活的测定DNS氧化还原糖，能使溶液显橙色。在一定还原糖的浓度范围内，还原糖的浓度越高橙色越深，可采用比色法求得还原糖的含量[7]。显色原理见图1。

不同浓度的标准葡萄糖溶液的制备：按表1所示的吸取量，将500 μg/mL的标准葡萄糖溶液稀释制备成6种浓度梯度的溶液，且试管依次标号为0,1，…，5号。然后再依次编号为0′，1′，…，5′的试管中加入上述对应管号中的溶液2.5 mL，再向1′，2′，…，5′号试管中都加入2.5 mL的DNS溶液，且0′号试管需加入2.5 mL的蒸馏水作为对照组。加完试剂后将各试管摇匀，最后将6支试管都放到煮开的热水浴中煮5 min。5 min过后取出所有试管，把它们放到冰水浴中冷却一段时间，冷却后将各支试管中的溶液用蒸馏水稀释3倍，稀释完后在721型分光光度计上比色。选用厚度为0.5 cm的比色皿，分光光度计设置波长为520 nm，按顺序测得各个试管的光密度(OD)值。绘制葡萄糖标准曲线，最后得出回归方程。

采用羧甲基纤维素钠(CMC)酶活力测定纤维素酶活力：在一支试管中，先量取经过适当稀释过后的粗酶液0.5 mL，然后加入2.0 mL的CMC缓冲溶液，使劲振荡试管使溶液得以充分混合，然后把它放到40 ℃的恒温水浴锅中0.5 h，用于酶液的糖化。糖化过后向试管中加入2.5 mL的DNS溶液。对照组的试验取一根空白试管，加入0.5 mL煮沸的酶液，然后依次加入2.0 mL的缓冲粗酶液、2.5 mL的DNS溶液。然后将加完试剂的2只试管同时放置于沸水浴中煮5 min，取出后用冷水加以冷却，过后用蒸馏水稀释3倍后用于分光光度计的测量。以第2支试管为对照，在520 nm波长处测得OD值，查阅标准曲线，将其代入回归方程中，从而算出溶液中的葡萄糖含量。

CMC酶活的计算公式：

式中：G为样品溶液中葡萄糖的含量(μg)；n为稀释倍数；30为糖化半小时(min)；180为葡萄糖分子量(g/mol)。

1.2.2稀释倍数对CMC酶活的影响称取一定量自然干燥的香菇菌糠，然后向其中加入10倍蒸馏水，放在匀浆机中充分打碎，然后于40 ℃恒温水浴振荡器中放置45 min，滤液置于离心机中以适当的转速离心一段时间，取上层清液即可。上清液用醋酸-醋酸钠缓冲液稀释不同的倍数，用于酶活力的测定。

1.2.3单因素试验酶是具有生物活性的物质，提取结果受多种外界因子的影响。为了提取理想的酶活，故应选择最合适的条件，单因素试验设计如表2所示。

1.2.4响应面设计在考察了上述3个单因素试验结果，将这3个因素作为目标变量，模型选用二次方程，试验因素及水平如表3所示。

2结果与分析

2.1葡萄糖标准曲线

配制不同浓度的标准葡萄糖液，用分光光度计分别测得各管内的光密度(OD)值。得到葡萄糖含量和吸光度的标准曲线如图2所示，并得出回归方程：y=0.0017x+0.0069。结果表明，葡萄糖含量与吸光度具有良好的相关性，其相关系数R2=0.9977，说明这种方法对微量葡萄糖的测定是可以接受的。

2.2稀释倍数对CMC酶活力的影响

如图3所示，当稀释倍数在2～3倍之间时，羧甲基酶的酶活性呈现增长的趋势，说明此稀释倍数是有利于纤维素酶的溶解释放。当稀释的倍数超过3倍后，CMC酶活力逐步递减，但最终不可能为0，说明酶的活性受到了抑制，因此选择稀释倍数为3倍。

2.3超声功率对CMC酶活力的影响

如图4所示，超声波功率在300～600 W之间时，香菇菌糠菌丝细胞组织的破损力度随着超声波功率的增加而加强，那么流出来的纤维素酶量也会增多。当功率在700～800 W之间时，羧甲基酶的活性降低，究其原因很可能是超声波的强烈振动使纤维素酶的结构遭到破坏；另外，浸提液流动得更快使物料在超声场中更少的滞留也是超声的作用，破坏细胞壁的程度也变得微弱了[8]。

2.4超声时间对CMC酶活力的影响

如图5所示，超声时间在10～20 min时，菌丝细胞壁的破损细碎粒度和羧甲基纤维素酶溢出量随时间的延长而增加。当时间超过20 min时，羧甲基纤维素酶的活性减弱，这可能是因为酶的活性受到溶出杂质抑制的缘故，0或者是超声波机械剪切作用破坏了酶分子结构的完整性。

2.5液料比对CMC酶活力的影响

如图6所示，液料比小于30 mg/L时，随着液料比的增加，羧甲基纤维素酶的活性也增大，因为随着浸提液体体积的增大，香菇菌糠和溶剂相互作用的时间就越长，那么更多的酶会溶解出来。在液料比超过30时，羧甲基纤维素酶的活性会降低，这可能是在液料比失衡过大时，时间耽搁和能量耗费的缘故，阻碍了超声波顺利破碎细胞的能力，使细胞破碎粒度下降[9]，从而使酶的得率减少；也有可能是因为液料比太大，浸提液中酶的浓度降低，导致底物降解速度变慢，致使酶的活性丧失。

2.6响应面分析法确定液制备最佳工艺条件

在考察了上述3个单因素试验结果后，将这3个因素作为目标变量，模型选用二次方程，试验结果如表4所示。

2.6.1模型的建立与显著性检验采用Design-Expert 8.0.6软件对表4中的试验数据进行拟合分析，建立数学模型，并根据模型方程得出最佳试验配方。得到的关于CMC酶活力(y1)的多元二次回归模型方程为：

y1=55.183-0.047765x1-2.76545x2-0.31658x3+3.9×10-4x1x2+1.8×10-4x1x3+6.15×10-3x2x3+2.8075×10-5x12+0.05353x22+1.2325×10-3x32

式中：y1为CMC酶活力，x1为超声功率，x2为超声时间，x3为液料比。

对CMC酶活力为目标函数建立的回归模型进行方程分析，回归方程系数显著性检验结果见表5。由表5可知，失拟项0.2840>0.05，不显著，表明建立的回归模型非常显著，能够较好地拟合超声功率、超声时间和液料比对CMC酶活力的影响。该模型的回归系数为0.9964，校正系数为0.9917，由此可见该方程的拟合程度较好，利用该模型对CMC酶活力优化试验进行预测分析的准确度较高。CMC酶活力受各种因素的影响不同，其中B、AB、AC、BC、A2、B2极为显著，A、C和C2显著。由方差分析结果可得，3个因素对CMC酶活力影响的大小为：B>C>A，即超声时间>液料比>超声功率。

2.6.2回归模型的相应曲面及等高线分析固定其中一个因素在零水平，可以通过模型方程作出三维曲面图和二维等高线对其中2个试验因素进行直观分析，也可以分析各因素间的交互作用。

如图7-a、图7-b所示，当液料比为30，超声功率一定时，产品的CMC酶活力上升，香菇菌糠菌丝细胞壁破碎度和羧甲基纤维素酶溶出量都将随之增加。如图7-c、图7-d所示，当超声功率为600 W，液料比一定时，随着时间的推移，产品CMC酶活力先降后升；而超声时间一定时，超声功率越大，产品CMC酶活力降低，但变化并不显著。如图7-e、图7-f所示，当超声时间为20 min，比较超声液料比与超声功率对产品的影响时发现，液料比对产品的影响变化趋势略显著高于超声功率。

注：*、**分别表示达显著、极显著水平。

2.6.3优化工艺的验证通过响应面软件分析可以得知，香菇菌糠纤维素酶最佳提取工艺为：超声功率500.08 W，超声时间15.05 min，液料比为20，在此条件下CMC酶活力为9.6 IU/g。将试验条件做如下调整：超声功率500 W，超声时间15 min，液料比为20，在此条件下做3次重复试验，CMC酶活力为9.61 IU/g，与理论值较为接近，由此可知，依据此响应面模型数据可有效指导试验操作。

3结论

本研究采用超声波浸提法从香菇菌糠中提取具有商品价值的纤维素酶，为纤维素酶的进一步分离纯化提供了参考的依据。在本试验条件下对纤维素酶浸提工艺进行优化，获得了最佳的香菇菌糠纤维素酶的提取工艺：超声功率500 W，超声时间15 min，液料比为20，在此条件下CMC酶活力为9.61 IU/g。

参考文献：

[1] 张坚.菌糠饲用酶制剂的研究[D].长沙：湖南农业大学，2007.

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[5] 钟国祥，姚健，张诚，等.纤维素降解菌的筛选及其酶学性质研究[J].江西农业学报，2015,27(6)：85-89.

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[9] 马怀良,龚振杰,任荣,等.滑子蘑菌渣粗纤维素酶浸提及其酶学特性研究[J].中国食用菌,2011,30(1):48-50.

(责任编辑：曾小军)

Optimization of Cellulase Extraction Process of Waste Material from Mushroom (Lentinusedodes)

FAN Dong1, LIU Shi-cao1, ZHU Ai-xia1,2*, CHEN Fan1

(1. Hubei Collaborative Innovation Center for Animal Nutrition and Feed Safety, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 2. Wuhan Livestock Feed Engineering Technology Research Center, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

Abstract：Cellulase of the waste material fromLentinusedodeswas prepared by ultrasonic extraction, the effects of ultrasonic power, ultrasonic time and liquid-solid ratio on the activity of cellulase were studied through single factor tests and response surface analysis. The results showed that the optimum process parameters were obtained as follows: ultrasonic power was 500 W, ultrasonic time was 15 min, liquid ratio was 20∶1, three validation tests under these conditions, the activity of the extracted cellulase was 9.61 IU/g.

Key words：Waste material fromLentinusedodes; Cellulase; Ultrasonic extraction; Response surface analysis

收稿日期：2015-03-29

基金项目：武汉轻工大学引进(培养)人才科研启动项目(2013RZ04)；国家科技支撑计划项目(2012BAD36B05)。

作者简介：范东(1993—)，男，湖北宜昌人，主要从事饲料添加剂及资源开发与利用研究。*通讯作者：祝爱侠。

中图分类号：S646.12

文献标志码：A

文章编号：1001-8581(2016)05-0083-05