HPLC梯度洗脱法同时测定壮血药酒中4种成分的含量

邢文峰，肖　莉

解放军第一九八医院，湖南 郴州 423000



*通信作者

HPLC梯度洗脱法同时测定壮血药酒中4种成分的含量

邢文峰*，肖莉

解放军第一九八医院，湖南 郴州 423000

[摘要]目的建立同时测定壮血药酒中新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素和佛手柑内酯4个主要成分含量的高效液相色谱检测方法。方法采用依利特C18柱；流动相A为乙腈-甲醇(1∶2)，流动相B为0.4%冰醋酸溶液，梯度洗脱；流速为1.1 mL/min；柱温为25 ℃；检测波长λ1=283 nm (新北美圣草苷和柚皮苷)，λ2=222 nm (补骨脂素和佛手柑内酯)。结果在优化的色谱条件下，新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素和佛手柑内酯的线性范围分别为6.52～130.40 μg/mL (r=0.999 7)、6.61～132.20 μg/mL (r=0.999 3)、6.75～135.00 μg/mL (r=0.999 6)、4.05～81.00 μg/mL (r=0.999 9)；4种成分的平均加样回收率(n=6)分别为96.94%、99.14%、98.09%、96.87%，RSD分别为0.75%、0.52%、1.18%、1.02%。结论该方法简便快捷，回收率、重复性良好，可用于壮血药酒中新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素和佛手柑内酯的含量分析。

[关键词]壮血药酒；新北美圣草苷；柚皮苷；补骨脂素；佛手柑内酯

0引言

壮血药酒是治疗贫血、病后体质虚弱、腰膝酸痛、妇女带下、月经不调等症状的中药复方制剂，现收载于部颁标准中药成方制剂第5册[1]，由骨碎补、五指毛桃、当归、黑老虎、何首乌(制)、白术(炒)、鸡血藤、甘草(炙)等加工而成，具有补气血、通经络、壮筋骨、健脾胃的功效。原质量标准仅对方中当归进行了薄层色谱定性，未对方中任何药味进行定量，经文献检索，未见对壮血药酒中所含成分进行定量的报道，本研究首次对壮血药酒药材骨碎补[2]和五指毛桃[3]中新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素和佛手柑内酯进行定量研究，建立了同时测定4种成分的方法，现报道如下。

1仪器与试药

安捷伦1200型HPLC色谱仪；VS-100UE型恒温超声波提取机；XS205DU型十万分之一电子天平；柚皮苷对照品(批号：110722-201312，含量以94.7%计，常温干燥、密闭遮光保存，使用前无需处理)、补骨脂素(批号：110739-201416，含量以99.9%计，常温保存)由中国食品药品检定研究院提供；新北美圣草苷对照品(批号：13241-32-2，含量以98.0%计)、佛手柑内酯(批号：484-20-8，含量以98.9%计)由上海同田生物技术股份有限公司提供；壮血药酒(每瓶装75 mL；批号：140235、140276、140291)购于国药集团冯了性(佛山)药业有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，冰醋酸为分析纯，水为重蒸馏水。

2方法

2.1色谱条件采用依利特C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A为乙腈-甲醇(1∶2)，流动相B为0.4%冰醋酸溶液，按表1进行梯度洗脱[4-9]；检测波长：0～29 min，λ1=283 nm[10-12]，29～50 min，λ2=222 nm[13]；流速采用1.1 mL/min；柱温采用25 ℃；进样量为20 μL。

表1　流动相梯度洗脱程序

2.2对照品溶液的配制方法

2.2.1对照品储备液的制备分别称取对照品新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素和佛手柑内酯适量，分别加50%乙醇溶解并稀释，制成质量浓度分别为0.652、0.661、0.675、0.405 mg/mL单一成分的对照品储备液。

2.2.2混合对照品溶液的制备按上述4种对照

品储备液顺序，分别依次吸取2.5、5.0、1.0、2.0 mL，用50%乙醇溶液稀释，制成每1 mL分别含新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯32.6、66.1、13.5、16.2 μg的混合对照品溶液。

2.3样品溶液的制备方法

2.3.1样品溶液的制备精密吸取壮血药酒6.0 mL，置于50 mL容量瓶中，用50%乙醇溶液稀释至刻度，振摇均匀，微孔滤膜过滤，取续滤液，作为样品溶液备用。

2.3.2阴性对照溶液的制备按照部颁标准《中药成方制剂》第5册壮血药酒质量标准中规定的处方工艺，分别制备不含骨碎补、五指毛桃的样品，按照文中“2.3.1”项下样品溶液的制备方法分别制备成骨碎补、五指毛桃空白溶液。

2.4线性关系考察分别精密吸取上述制备的对照品储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，将其分别置于10 mL量瓶中，用50%乙醇稀释成系列浓度的混合对照品溶液，在上述的色谱条件下，分别进样20 μL，进行测定，记录新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯的峰面积，以峰面积Y为纵坐标、对照品质量浓度X为横坐标，绘制标准曲线，回归方程、线性范围及r值见表2。

表2　线性关系实验结果(n=6)

3方法学考察

3.1专属性试验分别精密吸取样品溶液、混合对照品溶液、骨碎补空白溶液和五指毛桃空白溶液，参照上述色谱条件各进样20 μL进行测定，记录色谱峰。结果显示，在该色谱条件下，按保留时间先后的出峰顺序-新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯，样品溶液和混合对照品溶液所测的新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯的保留时间一致；空白样品在对照品相应位置处未呈现吸收峰。结果表明，处方中其他药物对所测成分的测定无干扰。色谱图见图1。

3.2精密度试验精密吸取“2.2.2”项下制备的混合对照品溶液20 μL，参照“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素和佛手柑内酯的峰面积，计算相对标准偏差，新北美圣草苷为1.25%、柚皮苷为0.67%、补骨脂素为0.84%、佛手柑内酯为1.08%。

3.3重复性试验按壮血药酒样品含量测定方法，对同一批号(批号：140235)的6份壮血药酒样品进行测定，记录新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素和佛手柑内酯的峰面积，计算相对标准偏差，结果新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素和佛手柑内酯峰面积的RSD依次为1.46%、0.38%、0.94%、1.13%，表明本研究的检验方法重复性良好。

3.4稳定性试验取同一批号的壮血药酒样品(批号：140235)的同一样品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定，结果显示，新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素和佛手柑内酯的RSD分别为0.98%、0.42%、0.87%、1.51%，表明24 h内样品溶液的稳定性良好。

图1　新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素和佛手柑内酯的HPLC

3.5加样回收率试验取9份已知含量的壮血药酒(批号：140235；新北美圣草苷为0.289 mg/mL、柚皮苷为0.561 mg/mL、补骨脂素为0.107 mg/mL、佛手柑内酯为0.132 mg/mL)适量，精密量取3.0 mL，置于50 mL容量瓶中，分别精密加入混合对照品溶液20、25、30 mL各3份，用50%乙醇溶液稀释至刻度，振摇均匀，滤过，取续滤液，作为加样样品试液。参照“2.1”项下的色谱条件，计算各组分回收率，结果上述成分的平均加样回收率(n=6)分别为96.94%、99.14%、98.09%、96.87%，RSD分别为0.75%、0.52%、1.18%、1.02%。

4样品测定

取3个不同批号的壮血药酒样品，参照“2.3.1”项下制备样品溶液的处理方法，按“2.1”项下的色谱条件进行分析、测定，结果见表3。

表3　样品含量测定结果(mg/mL)

5讨论

5.1流动相的选择分别采取乙腈-水[6,13]、甲醇-水[7]、乙腈-0.4%冰醋酸溶液[4]、甲醇-0.2%磷酸溶液[9]、乙腈-甲醇(1∶2)与0.4%冰醋酸溶液不同比例梯度洗脱，通过对各色谱峰的保留时间、峰形和分离度效果的对比，优选出最佳的检测用流动相，结果表明，在乙腈-甲醇(1∶2)与0.4%冰醋酸溶液为流动相按照文中比例洗脱时，各色谱峰的分布、峰形和分离度效果最佳，故选取乙腈-甲醇(1∶2)与0.4%冰醋酸溶液为壮血药酒中新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素和佛手柑内酯同时测定的流动相。

5.2多组分同时测定中药制剂的活性成分含量是反映其有效性的重要指标，壮血药酒现行标准仅对处方中当归进行了薄层色谱定性研究，未对所含成分进行定量测定，本研究建立的壮血药酒中新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素和佛手柑内酯含量测定方法，可以实现同时对处方中多味药材、多个指标成分的定量测定，不仅方法简便、可靠，且对其他含类似成分的中成药质量控制也具有借鉴作用。

参考文献：

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High-performance liquid chromatography for simultaneous determination of four components in zhuangxue yaojiu

XING Wen-fen*,XIAO Li

(the People′s Liberation Army 198 Hospital,Chenzhou 423000,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a high-performance liquid chromatography (HPLC) method for the simultaneous determination of four main components (neoeriocitrin,naringin,psoralen and bergapten) in zhuangxue yaojiu.MethodsThe HPLC separation was performed on an Hypersil C18column eluted,with a mobile phase consisting of acetonitrile-methanol (1∶2) as mobile phase A,and 0.4% acetic acid glacial solution as mobile phase B.The flow rate was 1.1 mL/min.The column temperature was at 25 ℃.Neoeriocitrin and naringin were detected at 283 nm,and psoralen and bergapten were detected at 222 nm.ResultsThe chromatographic peaks of 4 main components and the corresponding spectra were ideal under the optimal conditions.Neoeriocitrin,naringin,psoralen and bergapten had good linearity at 6.52～130.40 μg/mL (r=0.999 7),6.61～132.20 μg/mL (r=0.999 3),6.75～135.00 μg/mL (r=0.999 6),4.05～81.00 μg/mL(r=0.999 9),and the average recoveries and RSD were 96.94% (0.75%),99.14% (0.52%),98.09% (1.18%) and 96.87% (1.02%),respectively.ConclusionThe method is simple,economical and accurate with good reproducibility for the determination of neoeriocitrin,naringin,psoralen and bergapten.

Key words：Zhuangxue yaojiu;Neoeriocitrin;Naringin;Psoralen;Bergapten

收稿日期：2015-08-24

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201604025