柚皮苷对大鼠蛛网膜下腔出血脑血管痉挛及神经元凋亡的影响

苏静缘，李晓明

沈阳军区总医院神经外科，沈阳 110016



柚皮苷对大鼠蛛网膜下腔出血脑血管痉挛及神经元凋亡的影响

苏静缘，李晓明*

沈阳军区总医院神经外科，沈阳 110016

[摘要]目的研究柚皮苷对蛛网膜下腔出血(SAH)引起的脑血管痉挛以及神经元凋亡的影响，并分析其潜在机制。方法60只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、SAH模型组(SAH组)、柚皮苷治疗组(Nar组，80 mg/kg)，每组20只。各组10只大鼠取患侧大脑皮质匀浆液，检测MDA含量；另10只大鼠断头取脑，固定后常规包埋后切片，HE染色测基底动脉内径周长。TUNEL和NEUN免疫荧光双染检测大鼠脑皮质神经元凋亡。结果与模型组比较，柚皮苷能明显降低SAH氧化应激指标MDA的水平(P<0.01)；并显著抑制脑基底动脉血管痉挛(P<0.01)；免疫荧光结果显示，柚皮苷能显著减少SAH大脑皮质神经元凋亡的数量(P<0.01)。结论柚皮苷可以减轻大鼠SAH后早期脑血管痉挛，减少大脑皮质神经元凋亡的功能，其机制可能与抑制SAH后氧化应激有关。

[关键词]蛛网膜下腔出血；柚皮苷；血管痉挛；凋亡；氧化应激

0引言

蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)是最常见的脑血管疾病之一，而脑血管痉挛(Cerebral vasospasm，CVS)作为其严重和常见的并发症，是其致死、致残的重要原因。有研究表明，氧化应激是蛛网膜下腔出血发生脑血管痉挛的重要原因[1]。因此，寻找新的抗氧化剂对CVS进行早期干预对治疗SAH具有重要意义。

柚皮苷(Naringin)是中草药骨碎补、枳实、枳壳、橘红的主要有效成分，是目前研究、开发、利用广泛的天然药物植物活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗突变等多种活性药理效能，其神经保护作用在脑缺血[2]、癫疒间[1]等疾病中得到验证。但有关柚皮苷在SAH治疗中的应用目前尚未见报道。本实验对SAH模型大鼠进行腹腔注射柚皮苷，观察柚皮苷对SAH引起的脑血管痉挛以及神经元凋亡的影响，旨在为柚皮苷在SAH中的应用提供实验依据。

1材料与方法

1.1主要试剂药物柚皮苷购自天津士兰科技有限公司；TUNEL试剂盒和DAPI染液购自武汉博士德试剂公司；兔单克隆NEUN购自santa公司；荧光二抗试剂购自北京中杉金桥公司；MDA检测试剂盒购自南京建成科技有限公司。

1.2实验动物和大鼠蛛网膜下腔出血模型的制备清洁健康雄性SD大鼠，体重210~260 g，由沈阳军区总医院实验动物中心提供。术前12 h禁食，自由饮水。10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔麻醉，仰卧位固定于手术台上，颈部正中纵向切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，分离右侧颈总动脉，在靠近颈外动脉根部结扎颈外动脉并剪断，分离颈动脉分叉部；夹闭颈总动脉、颈内动脉。将单丝尼龙线自颈外动脉剪口处插入，松开颈内动脉血管夹，通过颈内动脉到大脑中动脉开口处，至有阻力感后再插入2 mm左右刺破willis环造成SAH，迅速将尼龙线拔出，整个过程不超过30 s。假手术组除不进线外，其余过程同SAH组。正常组不干预。以大鼠有明确的SAH或血凝块而无脑实质损害作为建模成功标准。

1.3大鼠分组与给药将60只SD大鼠随机分为3组：假手术组(Sham组，20只)，SAH模型组(SAH组，20只)，柚皮苷治疗组(Nar组，20只)。给药组柚皮苷用生理盐水稀释后，于SAH后0.5 h和23 h时腹腔注射，浓度80 mg/kg；SAH组给予等体积生理盐水。

1.4各组MDA活性的检测各组10只大鼠过量麻醉致死，取脑患侧皮质组织匀浆液，根据试剂盒标准步骤以硫代巴比妥酸钠法检测MDA含量，以考马斯亮蓝法检测匀浆液中蛋白含量。

1.5取材及切片各组另10只大鼠过量麻醉致死后，打开颅骨，剖取基底动脉与其附着的脑干和整个大脑，分离脑干和基底动脉，取包含脑干的基底动脉上1/2段做标本，将基底动脉置于4%中性甲醛固定，取材时保持管壁断面和血管壁垂直，常规脱水、透明、石蜡包埋和切片。

1.6基底动脉测量每个基底动脉连续取3个切片，层厚4 μm，苏木素-伊红(HE)染色。在光镜下观察，并利用Image Pro-Plus 6.0软件系统测量每个基底动脉的内径周长，作为评价CVS程度的指标。

1.7TUNEL和NEUN免疫荧光双染石蜡切片常规脱蜡至水，PBS水洗后，Proteinase K 37 ℃消化15 min，PBS水洗，每张切片滴加TDT+DIG-UTP混合液，37 ℃孵育2 h，PBS水洗，滴加封闭液室温30 min，甩去不洗，滴加抗地高辛抗体+neun抗体混合液，4 ℃过夜。PBS水洗后滴加荧光二抗(TUNEL-FITC+NEUN+TRITC)37 ℃孵育30 min。最后用DAPI复染细胞核，于荧光显微镜下观察。每例大鼠随机取6张切片，在出血侧大脑皮质区随机选取10个不重叠高倍镜视野(×400)，计数TUNEL和NEUN阳性细胞数。

2结果

2.1柚皮苷治疗对SAH后大脑皮质MDA含量的影响与Sham组比较，SAH组脑样本MDA含量明显升高(P<0.01)；与SAH组比较，Nar组的脑样本MDA含量明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1　柚皮苷治疗对SAH大脑皮质MDA含量的影响

注：*与Sham组比较，#与SAH组比较，P<0.01

2.2柚皮苷治疗对SAH基底动脉血管痉挛的影响与Sham组比较，SAH组和Nar组基底动脉管径及横截面积均明显变小，差异有统计学意义(P<0.01)；管壁明显挛缩增厚。而Nar组基底动脉的管径及横截面积均较SAH组增加，差异有统计学意义(P<0.01)；血管壁的皱缩及增厚程度也较SAH组有所减轻。见图1、表2。

图1　柚皮苷治疗对SAH基底动脉血管痉挛的影响(HE染色，×100)

组别只数基底动脉内径周长(μm)Sham组10295.67±78.45SAH组10205.92±45.14*Nar组10245.78±35.67*#

注：*与Sham组比较，#与SAH组比较，P<0.01

2.3柚皮苷治疗对SAH大脑皮质神经元凋亡的影响TUNEL和NEUN免疫荧光双染结果显示：Sham组中，TUNEL阳性细胞较少，几乎没有；SAH组TUNEL阳性细胞表达数量高于Sham组，差异有统计学意义(P<0.01)，并且部分TUNEL阳性细胞与NEUN共定位，说明凋亡细胞为神经元。Nar组的TUNEL阳性的凋亡细胞数较SAH组明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2、表3。

图2　柚皮苷治疗对SAH大脑皮质神经元凋亡的影响(荧光双染，×400)

3讨论

本实验应用大脑中动脉穿刺法制备大鼠SAH模型，模拟人类SAH损伤，在SAH后立即给予柚皮苷进行干预治疗，经生化水平检测，柚皮苷能减弱SAH引起的氧化应激指标MDA水平的升高；

表3　柚皮苷治疗对SAH大脑皮质神经元

注：*与Sham组比较，#与SAH组比较，P<0.01

运用HE染色定量基底动脉内径周长以评估动脉痉挛情况，结果显示，柚皮苷能抑制脑基底动脉血管痉挛；免疫荧光双染技术检测大脑皮质神经元凋亡情况，发现柚皮苷能有效抑制SAH大鼠皮质神经元的凋亡。

动脉瘤破裂引起的SAH是高致死率、致残率的神经外科疾病，严重威胁人类健康[3]。首先，SAH引起的氧化应激反应在SAH后早期CVS的发生发展过程起重要作用[4]。SAH后早期，蛛网膜下腔红细胞崩解释放大量的氧自由基，包括超氧化物、氢氧根、过氧化氢、一氧化氮和过氧亚硝酸根等；并且还伴随线粒体呼吸链、NADPH酶和抗氧化防御系统的破坏，降低活性氧增加量[1]。血管壁炎症反应诱导血管内皮细胞凋亡，血管屏障破坏，最终引起CVS[5]。氧自由基还可导致共价键的改变，诱导产生多种缩血管物质，如内皮素、血栓素A2、前列腺素H2等，并拮抗NO的舒血管作用，促进CVS发展。其次，SAH后产生的过量氧自由基可以直接作用于神经细胞膜上的不饱和脂肪酸，破坏神经细胞膜的完整性，引起神经细胞坏死，还可以直接攻击神经细胞内的线粒体，通过促进脂质过氧化、蛋白质变性、钙超载、DNA损伤等引起神经元损伤凋亡[6]。脑组织本身对自由基损伤缺乏足够抵抗力，需要外源性抗氧化剂来清除自由基。因此，有效的抗氧化剂有可能改善CVS和脑神经元凋亡，进而改善SAH。

柚皮苷是一种来自于葡萄柚的类黄酮化合物，在心肌梗死的研究中，应用柚皮苷能有效改善线粒体脂质过氧化和线粒体功能障碍，这说明柚皮苷有抗氧化作用[7-8]。也有研究应用柚皮苷治疗红藻氨酸(Kainic acid)引起的大鼠癫疒间，发现柚皮苷能穿过血脑屏障，发挥抗氧化、抗炎的神经保护作用[9]。在缺氧引起的脑损伤中，应用柚皮苷可以明显减少HIF-1α、VEGF和Caspase-3蛋白的表达，提示柚皮苷在缺氧引起的脑功能障碍中具有神经保护作用[10]。我们应用柚皮苷治疗SAH，发现其同样能抑制氧化应激，缓解脑血管痉挛和神经元凋亡。

综上所述，柚皮苷具有减轻大鼠SAH后早期CVS，减少大脑皮质神经元凋亡的功能，其机制可能与抑制SAH后氧化应激有关。然而，柚皮苷对SAH后神经炎症反应是否有影响目前知之甚少。因此，我们将进一步研究柚皮苷对SAH后神经炎症的影响。

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Effects of naringin on cerebral vasospasm and apoptosis after subarachnoid hemorrhage in ratsSU Jing-yuan,LI Xiao-ming*(Institute of Neurology,General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of naringin on cerebral vasospasm and neuronal apoptosis induced by subarachnoid hemorrhage in rats,and analyze the potential mechanisms.MethodsSixty SD rats were randomly divided into sham operation group (Sham group),SAH group,and naringin group (Nar group,80 mg/kg),20 rats in each group. Among 10 rats in each group,ipsilateral hemispheres of brains were homogenized to detect the MDA level. Another 10 rats’ brains were dissected and fixed-embedded sections,HE staining was conducted to detect the basilar artery diameter. The neuronal apoptosis was detected by immunofluorescent double staining with TUNEL and NEUN antibody.ResultsCompared with SAH group,naringin significantly attenuated the level of MDA-an oxidative stress marker (P<0.01),and inhibited cerebral vasospasm (P<0.01). The result of immunofluorescent double staining showed that naringin significantly attenuated the neuron apoptosis in brain cortex (P<0.01).ConclusionNaringin can attenuate cerebral vasospasm and decrease the number of neuron apoptosis in brain cortex in rats after SAH,the potential mechanism may be related with anti-oxidant after SAH.

Key words：Subarachnoid hemorrhage;Naringin;Cerebral vasospasm;Apoptosis;Oxidative stress

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201601002

*通信作者

收稿日期：2015-06-15