呋塞米对心衰大鼠心功能及心肌纤维化的影响

罗经宏，李　玲

惠州市中心人民医院a.老年病区，b.肿瘤放疗科，广东 惠州 516001



呋塞米对心衰大鼠心功能及心肌纤维化的影响

罗经宏a*，李玲b

惠州市中心人民医院a.老年病区，b.肿瘤放疗科，广东 惠州 516001

[摘要]目的探讨呋塞米对心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能及心肌纤维化的影响。方法采用结扎冠状动脉左前降支构建心肌梗死后心力衰竭大鼠模型。术后2周将34只大鼠随机分为3组：假手术组(10只，生理盐水)、心衰对照组(12只，生理盐水)及呋塞米组[12只，20 mg/(kg·d)]。药物干预4周后分别行超声心动图、血流动力学、心肌Masson染色，测定胶原容积分数(CVF)、血浆血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮以及心肌转化生长因子β1(TGF-β1)和胶原纤维Ⅲ(Collagen Ⅲ)mRNA的表达。结果与心衰对照组比较，呋塞米组的左室舒张末期压(LVEDP)明显升高(P<0.05)，而射血分数(EF)升高不明显。呋塞米组的AngⅡ、醛固酮、CVF及TGF-β1和Collagen Ⅲ mRNA的表达均显著升高(P<0.05)。结论呋塞米能进一步激活心衰大鼠的肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)，进而升高TGF-β水平，促进心肌纤维化重构，最终加剧心功能的恶化。

[关键词]心力衰竭；呋塞米；心功能；纤维化重构

0引言

心力衰竭(Heart failure，HF)为最常见的心血管疾病之一，其发生率随着人口老龄化的增长呈不断升高的趋势[1-2]。利尿剂作为唯一能减轻心衰患者液体潴留的药物，是心衰药物治疗的基石。但由于缺乏大规模的随机对照临床试验的评价，目前利尿剂对心衰患者心功能及预后的影响仍无确定性的结论[3-4]。短、中期临床研究结果显示，利尿剂能改善心衰患者的心功能，减轻症状，增加运动耐量[5]，终止利尿剂的治疗，心衰患者再住院及死亡发生的风险增加[6]。Eshaghian等[7]进行的一项长期随机对照研究表明，使用利尿剂可以增加HF患者的死亡危险，且袢利尿剂与HF死亡率呈剂量依赖关系，随着每日呋塞米剂量增加，患者的生存率逐渐下降。心肌纤维化重构是心衰发生发展的病理学基础，而转化生长因子-β(Transforming growth factor，TGF-β)能够促进心肌纤维化，在心衰病理性重构中发挥重要的作用。本研究通过构建心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，进一步评估呋塞米对心功能及心衰纤维化重构的影响，现报道如下。

1材料与方法

1.1实验动物健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，体重(210±20)g，购于中山大学医学部实验动物中心。

1.2心力衰竭动物模型的构建大鼠称重后，大腿肌肉注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，仰卧固定于手术台上，气管插管及连接小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司，HX-300)给予正压通气(潮气量7 mL/次，呼吸频率70次/min，呼/吸为1/1)。左侧胸部备皮及消毒后开胸暴露心脏，用7/0带线缝合针结扎冠状动脉左前降支，其后逐层缝合胸壁，关胸后继续机械通气20~30 min，待动物苏醒可自行翻身后拔除气管导管。其中10只不结扎冠状动脉，其余步骤与上述相同。

1.3实验分组及药物干预术后2周10只不结扎冠状动脉大鼠全部存活，归入假手术组(10只)。30只建模大鼠存活24只，随机分为2组，心衰对照组(12只)及呋塞米组(12只)。假手术组及心衰对照组采用生理盐水，呋塞米组采用20 mg/(kg·d)呋塞米灌胃干预4周。

1.4超声心动图评估心功能药物干预4周后，行超声心动图检测，以评估大鼠的心功能。大鼠称重麻醉后，用ATL-HDI5000型多功能超声诊断仪(S12探头，频率10 MHz)测量左室射血分数(Ejection fraction，EF)。

1.5血流动力学检测行超声心动图检查后，进一步行血流动力学检测评估大鼠心功能。将大鼠固定在手术台上，剪开颈部皮肤，分离颈部肌肉，暴露右侧颈总动脉，插入2F聚乙烯导管，肝素钠生理盐水(3 g/L)抗凝，将压力传感器与BIOPAC生物信号采集与处理系统连接，将导管逐渐从右颈动脉推送至左心室，测量并记录左室舒张末期压(Left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)。

1.6血浆血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)和醛固酮浓度的测定完成血流动力学测定后，通过腹主动脉留取5 mL动脉血置于含有肝素钠的抗凝管，4 ℃下以1 610×g离心10 min，吸取上清，分装保存于-80 ℃冰箱中备用。应用酶联免疫吸附试验对血浆AngⅡ和醛固酮进行浓度测定。ELISA试剂盒购自广州速聚生物科技有限公司，并严格按照说明书操作步骤进行测定。

1.7Masson染色及胶原容积分数测定将大鼠开胸留取心脏标本，在冰生理盐水下清除心腔内残存血，并去除心脏大血管根部及心房，分离左右心室，用滤纸吸干后在左心室中部横向切开，切取约1 mm厚的心脏标本浸泡于福尔马林溶液(100 g/L)中固定24 h，以留待病理切片Masson染色(由中山一院病理科协助完成)，其余心脏标本分装保存于-80 ℃冰箱中备用。经显微摄像系统，在放大200倍情况下，随机选取Masson染色切片中非梗死区域的5个视野输入计算机彩色病理图像分析系统(Image-Pro Plus 4.1，NIH)定量分析心肌胶原容积分数(Collagen volume fraction，CVF)。CVF=非梗死区胶原面积/全视野面积(其中胶原面积不含血管周围面积)。

1.8心肌组织中TGF-β1、CollagenⅢ mRNA的检测收集大鼠心肌匀浆，采用Trizol试剂抽提总RNA，测定纯度、浓度后进行实时定量荧光PCR半定量测定。各分子的引物序列见表1。以β-actin为内参照，PCR反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，共40个循环。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳，采用Image tools凝胶分析系统对PCR产物进行定量分析，以β-actin相对值记录结果。

表1　TGF-β1、Collagen Ⅲ及内参引物序列

2结果

2.1三组左室射血分数变化与假手术组比较，心衰对照组及呋塞米组的EF明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。呋塞米组EF高于心衰对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.2三组血流动力学变化与假手术组比较，心衰对照组和呋塞米组的LVEDP明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。呋塞米组的LVEDP高于心衰对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.3三组胶原容积分数比较Masson染色在光镜下心肌呈红色，胶原纤维呈蓝色，细胞核呈黑色。通过计算机彩色病理图像分析系统半定量分析心肌的CVF。结果显示，与假手术组比较，心衰对照组及呋塞米组的CVF明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。而与心衰对照组比较，呋塞米组的CVF明显升高(P<0.05)。见图3。

图1　左室射血分数变化

图2　血流动力学变化

图3　心肌胶原容积分数

2.4血浆AngⅡ及醛固酮结果与假手术组比较，心衰对照组的AngⅡ及醛固酮水平显著升高(P<0.05)。而与心衰对照组比较，呋塞米组的血浆AngⅡ及醛固酮水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4　血浆AngⅡ及醛固酮水平

2.5心肌组织TGF-β1及CollagenⅢ mRNA表达与假手术组比较，心衰对照组TGF-β1及CollagenⅢ mRNA表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。而与心衰对照组比较，呋塞米组的TGF-β1及CollagenⅢ mRNA表达显著升高(P<0.05)。见图5。

图5　TGF-β1及CollagenⅢ mRNA表达

3讨论

利尿剂作为唯一能缓解心衰患者水钠潴留的药物，是心衰治疗的基石。袢利尿剂作为心衰治疗的老药，国内外有多项关于袢利尿剂治疗心力衰竭的研究，因研究年代多较早，研究方法不完善，样本量偏小，所以至今无法全面评估袢利尿剂在心力衰竭治疗中的获益及风险。

在目前的心衰治疗中，利尿剂往往不单独用来控制心衰的症状，多是在应用利尿剂基础上，加用β受体阻滞剂、ACEI或ARB及醛固酮受体阻滞剂等药物改善心功能及心脏重构，进而改善心衰患者的预后。一般认为，利尿剂短期应用能减轻心衰患者水钠潴留及气促的症状，进而改善生活质量及减少再住院率。而长期大剂量应用则由于存在利尿剂抵抗，对水电解质平衡、代谢及肾功能的影响，可能对心功能有不利的影响，增加心衰患者的死亡率。本研究应用呋塞米4周后，心衰大鼠的EF无明显的升高，而LVEDP较心衰对照组升高。结果表明，应用呋塞米4周不能很好地改善心衰大鼠的心功能，甚至有加剧心功能恶化的作用。此结果与之前的研究结果相符。

RAAS及交感神经系统等神经内分泌因素的激活在心衰的发生发展中起重要作用。心衰患者长期大剂量应用利尿剂能进一步激活RAAS，可使血浆肾素、血管紧张素及醛固酮水平上升[8]。本研究结果显示，应用呋塞米4周后，血浆Ang Ⅱ及醛固酮的水平显著升高，表明即使是较小剂量的呋塞米，在短期应用后也能进一步激活RAAS，不利于心功能的好转及心衰预后的改善。

在心肌损伤部位及相邻心肌发生纤维化是心肌僵硬度增加及心脏收缩功能不全的病理基础[9]。而长期应用呋塞米对心肌纤维化的影响仍不明确。本研究结果表明，呋塞米能促进心肌梗死后心力衰竭大鼠的心肌纤维化。TGF-β是多功能的细胞因子，广泛参与炎症、细胞外基质沉积、细胞增殖、分化和生长等多种细胞功能的调节。

TGF-β能够促进心血管和肾组织的纤维化[10]，在结构性心脏病心肌组织中表达明显上调[11]。本研究结果显示，呋塞米组心肌TGF-β mRNA的水平较心衰对照组明显上升，表明呋塞米可能通过激活TGF-β，进而促进心衰的纤维化重构。

综上所述，呋塞米能进一步激活心力衰竭的RAAS，进而激活下游的TGF-β水平，促进心肌纤维化重构，最终加剧心肌梗死后心力衰竭大鼠的心功能恶化。

参考文献：

[1]Roger VL,Go AS,Lloyd-Jones DM,et al.Heart disease and stroke statistics-2011 update:a report from the American Heart Association[J].Circulation,2010,123:e18-e209.

[2]Lloyd-Jones D,Adams RJ,Brown TM,et al.Executive summary:heart disease and stroke statistics-2010 update:a report from the American Heart Association[J].Circulation,2010,121:948-954.

[3]安芳,王林.利尿剂的不良反应及对心力衰竭预后影响的研究进展[J].心血管病学进展,2011,32(2):205-208.

[4]李建辉,郝国贞.襻利尿剂在心力衰竭治疗中的应用进展[J].河北医药,2011,33(22):3466-3467.

[5]Faris R,Flather M,Purcell H,et al.Current evidence supporting the role of diuretics in heart failure:a meta analysis of randomised controlled trials[J].Int J Cardiol,2002,82(2):149-158.

[6]Faris R,Purcell H,Poole-Wilson PA,et al.Diuretics for heart failure[J].Cochrane Database Syst Rev,2006,(1):3838-3841.

[7]Eshagllian S,Horwich TB,Fonamw GC.Relation of loop diuretics dose to mortality in advanced heart failure[J].Am J Cardiol,2006,97(12):1759-1764.

[8]Sata Y,Krum H.The future of pharmacological therapy for heart failure[J].Circ J,2010,74(5):809-817.

[9]Krenning G,Zeisberg EM,Kalluri R.The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis[J].J Cell Physiol,2010,225(3):631-637.

[10]Dobaczewski M,Bujak M,Li N,et al.Smad3 signaling critically regulates fibroblast phenotype and function in healing myocardial infarction[J].Circ Res,2010,107:418-428.

[11]Henriett B,Karuly R,Laszlo H,et al.Crosstalk between TGF-β signaling and the microRNA machincry[J].Cell,2012,33:382-390.

Effect of furosemide on cardiac function and myocardial fibrosis in heart failure ratsLUO Jing-honga*,LI Lingb(a.Department of Geriatrics,b.Department of Radiation,Huizhou Municipal Central Hospital,Huizhou 516001,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the effect of furosemide on cardiac function and myocardial fibrosis in rats with heart failure after myocardial infarction.MethodsHeart failure was produced by ligation of the left anterior descending coronary artery in rats. Two weeks after the ligation,34 rats were randomly divided into 3 groups:Sham operation group (n=10),heart failure group (n=12) and furosemide group (n=12). Echocardiography,hemodynamic measurements,Masson’s trichrome staining and collagen volume fraction,plasma angiotensin Ⅱ and aldosterone levels,the mRNA expression of TGF-β and Collagen Ⅲ in the myocardium were detected at four weeks after drug intervention.ResultsCompared with the heart failure group,the left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) in furosemide group was significantly higher (P<0.05),but no significant difference was found in ejection fraction (EF). In addition,plasma angiotensin Ⅱ and aldosterone levels,myocardial collagen volume fraction and the mRNA expression of TGF-β and Collagen Ⅲ increased significantly(P<0.05).ConclusionFurosemide can further activate the heart failure RAAS,and increase TGF-β level,promote the reconstruction of myocardial fibrosis,ultimately exacerbate the deterioration of cardiac function.

Key words：Heart failure;Furosemide;Cardiac function;Myocardial fibrosis

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201601005

*通信作者

收稿日期：2015-05-22