HPLC法同时测定更年灵胶囊中3种成分的含量

邹　燕,龚秋翼,赵佳丽

浙江省嘉兴市食品药品检验检测院，浙江 嘉兴



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HPLC法同时测定更年灵胶囊中3种成分的含量

邹燕,龚秋翼,赵佳丽

浙江省嘉兴市食品药品检验检测院，浙江 嘉兴

[摘要]目的建立高效液相色谱法同时测定更年灵胶囊中淫羊藿苷、维生素B1及维生素B6的含量。方法采用高效液相方法，色谱柱：Ultimate AQ-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.04%庚烷磺酸钠溶液(含0.12%的三乙胺，用冰醋酸调节pH值至3.3)(A)-乙腈(B)梯度洗脱；检测波长：270 nm；柱温：20 ℃；流速：1.0 mL/min。结果淫羊藿苷、维生素B1和维生素B6分别在4.052～48.624、21.63～255.12和20.50～246.00 μg/mL范围内，与其峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 8、1.000、1.000，n=6)。平均回收率(n=6)分别为99.37%(RSD=1.08%)、100.93%(RSD=1.70%)和99.34%(RSD=1.76%)。结论该法操作简便，结果准确、重复性好，可用于更年灵胶囊的质量控制。

[关键词]更年灵胶囊；淫羊藿苷；维生素B1；维生素B6；高效液相色谱法

0引言

更年灵胶囊作为妇女更年期综合征的复方制剂，由淫羊藿、维生素B1、女贞子、谷维素、维生素B6组成。具有温肾益阴、调补阴阳的功效。其质量标准收载于卫生部药品标准中药成方制剂第十四册[1]或遵照国家食品药品监督管理局标准(试行)，虽然部分药企已经对质量控制项目做了更新及完善，但是没有统一规范的质量标准，不利于药品质量的监管。本文通过建立高效液相的方法，同时测定更年灵胶囊中淫羊藿主成分淫羊藿苷及维生素B1、维生素B6的含量，以达到有效控制产品质量的目的。

1仪器和试药

1.1仪器Agilent 1260高效液相色谱仪(安捷伦公司)；XS105DU电子天平(梅特勒-托利多有限公司)；Delta320H酸度计(梅特勒-托利多有限公司)；超纯水(密理博超纯水器，Milli-Q)；超声波清洗仪(USC-502，上海波龙电子设备有限公司，超声频率：58 kHz)。

1.2试药淫羊藿苷对照品(批号：110737-200415，供含量测定用)、维生素B1对照品(批号：100390-200502，供含量测定用)、维生素B6对照品(批号：100116-200415，供含量测定用)，均由中国生物制品检定研究院提供；乙腈(色谱纯，德国德姆施塔市墨客股份有限公司)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。更年灵胶囊(河北百善药业有限公司，批号：150101；通化振林药业有限责任公司，批号：130302)。

2方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1对照品溶液的制备精密称取105 ℃干燥至恒重的维生素B1对照品21.26 mg和维生素B6对照品20.50 mg，同置20 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液1。另精密称取淫羊藿苷对照品10.13 mg，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液2。精密量取对照品储备溶液1、2各1 mL，同置10 mL容量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备取更年灵胶囊(河北百善药业有限公司，批号：150101)装量差异项下内容物约0.3 g，精密称定，置100 mL容量瓶中，加稀乙醇约80 mL，超声30 min，冷却，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。

2.1.3阴性对照溶液的制备依更年灵胶囊处方制备缺淫羊藿苷、维生素B1、维生素B6的阴性样品，按供试品溶液制备方法配制，得阴性对照。

2.2色谱条件色谱柱：Ultimate AQ-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.04%庚烷磺酸钠溶液(含0.12%的三乙胺，用冰醋酸调节pH值至3.3)(A)-乙腈(B)梯度洗脱，0~11 min A∶B(88∶12)，12~20 min A∶B(67∶33)；检测波长：270 nm；柱温：20 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；记录色谱图，见图1，在该色谱条件下更年灵胶囊中淫羊藿苷、维生素B1、维生素B6峰与相邻色谱峰的分离度均大于2.0，且淫羊藿苷峰理论板数不低于10 000；阴性对照溶液在此3组分保留时间处均无色谱峰出现，表明样品中的其他组分对实验结果无干扰。

图1　更年灵胶囊三组分HPLC色谱图

2.3线性关系考察取“2.1.1”项下对照品储备溶液1、2，加稀乙醇分别制成含淫羊藿苷4.052、8.104、16.208、24.312、36.468、48.624 μg/mL，含维生素B121.63、42.52、85.04、127.56、191.34、255.12 μg/mL，含维生素B620.50、41.00、82.00、123.00、184.50、246.00 μg/mL的线性关系对照品溶液。按“2.2”项色谱条件进样20 μL，得线性回归方程。淫羊藿苷的回归方程：Y=42.602 X+18.865，r=0.999 8；维生素B1的回归方程：Y=33.054 X+4.960，r=1.000；维生素B6的回归方程：Y=15.142 X+12.802，r=1.000。结果表明，淫羊藿苷、维生素B1和维生素B6分别在4.052～48.624、21.63～255.12和20.50～246.00 μg/mL范围内，与其峰面积呈良好的线性关系。

2.4精密度试验精密吸取对照品溶液20 μL，进样6次，记录色谱图，计算淫羊藿苷、维生素B1、维生素B6峰面积的RSD(n=6)分别为0.1%、0.1%、0.2%，表明本方法的精密度良好。

2.5重复性试验按“2.1.2”项方法平行制备5份供试品溶液(河北百善药业有限公司，批号：150101)，分别进样，记录色谱图，计算淫羊藿苷、维生素B1、维生素B6的平均含量(n=5)分别为5.132、34.209、31.796 mg/g，RSD分别为1.0%、1.4%、1.2%，表明本方法的重复性良好。

2.6稳定性试验按“2.1.2”项方法制得供试品溶液(河北百善药业有限公司，批号：150101)，分别于0、2、4、6、8 h进样20 μL，计算淫羊藿苷、维生素B1和维生素B6峰面积的RSD(n=5)分别为0.1%、0.2%和0.1%。表明本法的供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.7加样回收率取已知含量的样品(河北百善药业有限公司，批号：150101)约0.3 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇约40 mL，超声30 min，冷却，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL和“2.1.1”项对照品储备溶液1、2各1 mL，同置10 mL容量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，得回收率试验溶液。分别进样20 μL，计算淫羊藿苷、维生素B1、维生素B6的回收率，结果见表1。

2.8样品测定取2批样品，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，进样测定，按外标法以峰面积计算含量。结果见表2。

3讨论

3.1本品中淫羊藿苷定量测定的方法收录于《中国药典》一部[2]，方法成熟，为确保更年灵胶囊的产品质量，有必要规范其淫羊藿苷的含量。目前关于更年灵胶囊中维生素B1、维生素B6含量测定的文献较多[3-4]，实验证明，本法中淫羊藿苷、维生素B1、维生素B6峰与相邻峰能完全分离，且柱效高，采用梯度洗脱，不仅提高了维生素B1和维生素B6的分离度，而且加快了淫羊藿苷的出峰时间，使得3组分能用同一色谱条件加以控制，大大提高工作效能。

表1　样品回收率试验结果

表2　样品测定(mg/g)

3.2超声时间的选择按“2.1.2”项所述方法制备3组供试品溶液，超声时间分别选择10、20、30 min，进样分析，结果显示，超声30 min淫羊藿苷、维生素B1的含量明显提高，故选择30 min作为供试品制备的超声时间。

3.3检测波长的选择用实验用溶剂配制淫羊藿苷、维生素B1、维生素B6对照溶液，采用紫外分光光度计测定三组分的最大吸收波长。淫羊藿苷在270、321、350 nm处有最大吸收；维生素B1在237、262 nm波长处有最大吸收；维生素B6在209、291 nm波长处有最大吸收。综合考虑，选择270 nm作为检测波长，在此波长下，淫羊藿苷、维生素B1、维生素B6均有良好峰形。

3.4流动相的选择实验初始选择乙腈-0.04%庚烷磺酸钠溶液(用冰醋酸调节pH值至3.0)，维生素B1及维生素B6的柱效不理想，后改用本方法色谱条件，峰形得到改善。

3.5柱温的选择实验中分别选择20、30、40 ℃为柱温，进样分析，结果在20 ℃时维生素B6峰与相邻峰的分离度明显提高，故选择20 ℃作为实验柱温。

综上所述，本法选定的色谱条件效率高，分离度好，柱效理想；而样品的前处理也简单、快速。故采用HPLC法同时测定更年灵胶囊中淫羊藿苷、维生素B1和维生素B6的含量是可行的。这也为药品标准修订提供了思路。

参考文献：

[1]中华人民共和国卫生部药品标准.中药成方制剂[S].第十四册,1997:64.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社,2010:306.

[3]吕天姿，王雅丽，张馨木.HPLC测定更年灵胶囊中维生素B1和维生素B6的含量[J].华西药学杂志,2007,22(3):326-327.

[4]陈珊珊，陈永红，孙玉滨，等.反相离子对色谱法同时测定更年灵胶囊中维生素B1和维生素B6的含量[J].中国现代中药，2007,9(1):27-29.

Determination of icariin,vitamin B1and vitamin B6in gengnianling capsule by HPLCZOU Yan，GONG Qiu-yi，ZHAO Jia-li (Zhejiang Jiaxing Institiute for Food and Drug Control，Jiaxing 314000,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a method for simultaneous determination of icariin,vitamin B1and vitamin B6in gengnianling capsule by HPLC.MethodsThe HPLC with Ultimate AQ-C18(250 mm × 4.6 mm,5 μm) column was used,mobile phase was heptanesulfonic acid sodium salt solution (A)-acetonitrile (B) gradient elution,the detection wavelength was at 270 nm;The column temperature was 20 ℃ with the flow rate of 1.0 mL/min.ResultsThe linear range of icariin,vitamin B1and vitamin B6was 4.052~48.624 μg/mL (r=0.999 8 ),21.63~255.12 μg/mL (r=1.000) and 20.50~246.00 μg/mL (r=1.000),the recovery rates were 99.37% (RSD=1.08%),100.93%(RSD=1.70%) and 99.34%(RSD=1.76%).ConclusionThe method is simple and accurate with good reproducibility,and it can be used for the quality control of gengnianling capsule.

Key words：Gengnianling capsule;Icariin;Vitamin B1;Vitamin B6;HPLC

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201601020

收稿日期：2015-05-30