李冬梅,张元媛,徐 丽,曹军平
武警总医院a.药剂科,b.消毒供应科,北京 100039
*通信作者
槲皮素对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究
李冬梅a,张元媛a,徐丽a,曹军平b*
武警总医院a.药剂科,b.消毒供应科,北京 100039
[摘要]目的探讨槲皮素(QU)对心肌缺血再灌注(MI/R)损伤的保护作用及其作用机制。方法采用结扎左冠脉前降支30 min再灌注2 h的方法复制MI/R损伤大鼠模型,随机分为假手术组、模型组、QU组(25、50、100 mg/kg),每组10只,各组于术前1周开始灌胃给药,1次/d。再灌注后取心脏,染色法测定心肌梗死面积;免疫组化法测定心肌组织NF-κB和ICAM-1表达情况;取心肌匀浆,髓过氧化物酶(MPO)法测定中性粒细胞浸润情况。结果QU高、中剂量可分别缩小心肌梗死面积至25.00%、25.31%,与模型组(32.55%)比较差异有统计学意义(P<0.05);QU各剂量组心肌MPO活力分别降低至185.70、190.66、210.03 U/g,与模型组(311.72 U/g)比较差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);QU各剂量组心肌组织ICAM-1阳性区面积百分比分别降至32.08%、32.65%、36.42%,与模型组(42.67%)比较差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);QU高、中剂量可使心肌NF-κB的表达水平分别降低至55.23%、54.90%,与模型组(61.05%)比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论QU预处理可保护MI/R所致心肌损伤,其机制与抑制中性粒细胞浸润、下调NF-κB和ICAM-1的表达等有关。
[关键词]槲皮素;心肌缺血再灌注损伤;中性粒细胞;细胞间黏附分子-1;核因子-κB
0引言
槲皮素(Quercetin,QU)属于黄酮类化合物,广泛存在于植物的花、叶和果实中,具有多种生物学活性和重要的药用价值,其已知药理作用包括抗肿瘤、抗氧化、抗炎、免疫抑制和心血管保护等[1],最近研究发现其还具有抗衰老、降血糖、抗抑郁等作用[2],在医药、保健等方面具有广阔的应用前景。近年研究证实,QU在体内外对心肌缺血再灌注(Myocardial ischemia/reperfusion,MI/R)损伤的心肌组织具有保护效应[3-4],然而其机制尚不清楚。本研究应用MI/R损伤大鼠模型,拟探讨QU心肌保护作用机制,为临床用药提供实验依据。
1材料与方法
1.1动物清洁级SD大鼠,雌雄各半,体重180~220 g,由河北医科大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(冀)2008-1-003。
1.2药品和试剂QU(纯度≥95%)购自Sigma公司,用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配成所需浓度。氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、髓过氧化物酶(MPO)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。核因子-κB(NF-κB)p65多克隆一抗、过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)多克隆抗体试剂盒、链霉亲和素-生物素复合物(SABC)法免疫组织化学试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.3方法
1.3.1建立MI/R损伤模型采用冠脉结扎法建立MI/R损伤模型,参照文献[5]加以改进。取大鼠,术前12 h禁食不禁水,戊巴比妥钠35 mg/kg腹腔注射麻醉后,仰位固定,四肢连接ECG-1350P型十二导联心电图机。颈部分离气管,插入气管插管,连接DW-3000型动物人工呼吸机(呼吸频率60次/min,潮气量2 mL/100 g)。顺肋间隙方向于胸骨左旁第3、4肋间开胸,分别在第3、4肋上环绕1根0号手术线,牵拉手术线使肋骨撑开,暴露心脏,沿左心耳下缘冠脉前降支起始部3~4 mm处用4-0带线缝合针穿过,进针深度控制在0.1 cm左右,将一小段直径1.5 mm的乳胶管置于结扎线下,收紧结扎线以造成心肌缺血,约30 min后(冠脉结扎成功的标志:心电图ST段明显抬高或T波高耸),松开结扎线再灌注2 h(再灌注成功的标志:抬高的ST段下降1/2以上或高耸的T波下降)。结扎前心电图不正常者,未到观察终点而死亡者及造模不成功者剔除。
1.3.2分组和给药将成模大鼠随机分为QU低、中、高剂量组(25、50、100 mg/kg)及模型组,每组10只。另取10只大鼠,开胸但不结扎冠脉,作为假手术组。各组于术前1周开始灌胃给药,1次/d,假手术组和模型组给予等体积0.5% CMC-Na。
1.3.3心肌梗死面积的测定取心脏,用PBS缓冲液洗后,去除心房、血管及脂肪组织,在冠脉结扎线下,从心尖起将心室平行切成厚度相等的5片,放入0.1% NBT溶液中,37 ℃染色15 min。梗死心肌呈灰白色,正常心肌则呈蓝色,图像采集后,通过软件ImagePro Plus 7.0测算梗死区面积和心室总面积,计算心肌梗死面积(%)[6]。
1.3.4心肌髓过氧化物酶(MPO)活力的测定取部分心脏,生理盐水洗后,上自动匀浆机制成匀浆,3 500 r/min离心10 min得上清,采用比色法分光光度计460 nm下测定OD值,并计算MPO活力,具体步骤按试剂盒说明书进行。
1.3.5心肌组织NF-κB和ICAM-1表达的测定取心脏,生理盐水洗后,在冠脉结扎线下取心肌行冰冻切片,厚度8 μm,采用免疫组化法检测NF-κB和ICAM-1的表达情况,具体步骤按试剂盒说明书进行,以PBS代替一抗作为阴性对照。图像采集后,通过软件ImagePro Plus 7.0分析图像,其阳性追踪点为表达于胞浆或胞核的棕黄色颗粒状物,测量阳性染色区面积,结果用阳性区面积百分比(阳性染色区面积/视野面积)表示。
2结果
2.1QU对心肌梗死面积的影响假手术组不纳入统计学比较;模型组大鼠心肌梗死面积达32.55%,QU高、中剂量组可分别使心肌梗死面积缩小至25.00%、25.31%,与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。
图1 各组心肌梗死面积比较(n=10)
2.2QU对中性粒细胞浸润的影响缺血30 min再灌注2 h后,模型组大鼠心肌MPO活力显著升高至311.72 U/g,与假手术组(27.60 U/g)比较差异有统计学意义(P<0.01);QU各剂量组心肌MPO活力分别降低至185.70、190.66、210.03 U/g,与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01),提示QU可减轻中性粒细胞浸润。见图2。
图2 各组心肌MPO活力比较(n=10)
2.3QU对心肌ICAM-1和NF-κB表达的影响缺血30 min再灌注2 h后,模型组大鼠心肌组织ICAM-1、NF-κB的表达水平分别升高至42.67%、61.05%,与假手术组(分别为11.73%、6.29%)比较差异均有统计学意义(P<0.01);QU各剂量组心肌组织ICAM-1阳性区百分比分别降低至32.08%、32.65%、36.42%,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);QU高、中剂量可使心肌组织NF-κB的表达水平分别降至55.23%、54.90%,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。
图3 各组心肌ICAM-1和NF-κB表达比较(n=10)
3讨论
药物预处理可保护MI/R损伤的心肌组织,研究发现,此作用主要通过促使机体释放生物活性物质或直接激活保护机制,增强心脏对缺血、缺氧的耐受而实现的[7]。本研究采用缺血前给药的方式观察QU预处理对MI/R损伤的保护作用,结果显示,QU(50、100 mg/kg)能显著缩小心肌梗死面积,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05),提示QU对MI/R损伤大鼠具有一定的心肌保护作用。
MI/R损伤是一个包括中性粒细胞活化、多种细胞因子及黏附分子过度表达、伴有多种炎性介质及信号传导分子参与的复杂过程,研究表明,以中性粒细胞浸润为主的炎症是造成MI/R损伤的重要因素之一[8],更有学者认为MI/R损伤是“中性粒细胞依赖”[9]。MI/R发生时激活的中性粒细胞聚集到心肌组织,通过一系列病理机制造成心肌细胞的损伤和功能的丧失,如:释放炎性介质、细胞毒性产物,直接损伤心肌;黏附于微循环,阻塞毛细血管,造成“无复流现象”;释放氧自由基,增强脂质过氧化反应,导致内皮细胞功能障碍等[10]。通过对大鼠MI/R心肌组织的中性粒细胞进行定量分析,发现其含量较正常心肌组织显著升高,且在再灌注2 h时达到峰值[11]。研究证实,抑制中性粒细胞浸润能显著降低MI/R损伤的程度,抗中性粒细胞治疗有可能成为防治MI/R的有效措施[8,12]。MPO酶为中性粒细胞所特有,通过分析该酶的活力,可判断中性粒细胞浸润的程度。本研究结果表明,缺血再灌注后MPO活性显著升高,提示中性粒细胞浸润明显;QU预处理可使心肌MPO活性明显下降(P<0.05,P<0.01),提示QU可通过抑制心肌内中性粒细胞浸润、减轻炎症反应来保护受损的心肌组织。
黏附分子ICAM-1(CD54)属免疫球蛋白超家族成员,存在于白细胞、内皮细胞和心肌细胞等细胞表面[13]。ICAM-1在MI/R损伤的病理机制中发挥重要作用,是介导中性粒细胞浸润的最重要因素之一。有研究表明,生理条件下,心肌细胞仅表达极少量的ICAM-1,但当MI/R发生时,在多种炎性介质及细胞因子的作用下,心肌细胞ICAM-1表达量会成倍增加[14]。ICAM-1在心肌细胞的高表达可刺激中性粒细胞与血管内皮细胞黏附,介导中性粒细胞对心肌组织的浸润,最终导致心肌细胞受损、死亡[15]。崔世涛等[16]研究发现,应用ICAM-1单抗可抑制中性粒细胞与血管内皮细胞之间的黏附,减少中性粒细胞在心肌内积聚,改善心肌灌注,减少心肌损伤。唐旭东等[17]在MI/R损伤家兔模型的研究中发现,ICAM-1的表达在再灌注120 min开始增高,并与中性粒细胞浸润数升高有相关性。Benson等[18]认为,ICAM-1有可能会成为防治心肌缺血疾病的一个理想靶点。
本研究结果表明,冠脉结扎30 min再灌注2 h后,心肌组织ICAM-1表达明显升高,与上述文献报道结论一致;QU各剂量可使心肌组织ICAM-1的表达阳性区百分比显著降低,与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01),提示QU通过抑制ICAM-1表达,减少中性粒细胞等炎性细胞向心肌细胞浸润,从而减轻心肌组织损伤。
NF-κB广泛存在于各种类型细胞(包括心肌细胞、血管内皮细胞)中,作为一种具有基因转录多向调控作用的转录因子,可调控多种炎症相关蛋白基因的表达[19]。生理条件下,NF-κB以非活性状态存在于胞浆中,当MI/R发生时,NF-κB得以活化,进入细胞核,调控一系列靶基因的表达,如ICAM-1、TNF-α、IL-1、IL-6等。这些炎症介质可促使中性粒细胞在心肌缺血区血管中黏附、聚集,并浸润心肌组织,造成血管及心肌损伤;上述炎症介质又会进一步激活NF-κB,形成恶性循环[20]。杨锐等[21]观察了大鼠心肌缺血的不同再灌注时程NF-κB p65蛋白表达的变化,结果显示,NF-κB p65蛋白表达量于再灌注60 min时达高峰,再灌注120 min时依然维持在高水平。Li等[22]研究表明,抑制NF-κB活性后,MI/R大鼠心肌损伤的程度明显减轻。由此可见,NF-κB被激活启动多种炎症介质的表达是MI/R损伤的重要机制之一。本研究观察显示,冠脉结扎30 min再灌注2 h后,心肌组织NF-κB p65蛋白表达显著增加,与模型组比较,QU高、中剂量(50、100 mg/kg)可使心肌组织NF-κB p65蛋白表达水平降低(P<0.05),提示QU通过抑制NF-κB活性,抑制其下游调控基因的表达,这可能是QU心肌保护作用机制的一个方面。
综上,QU预处理可下调黏附分子ICAM-1表达,减少中性粒细胞浸润,抑制转录因子NF-κB活性,缓解缺血再灌注过程中的炎症反应,进而实现对MI/R损伤心肌的保护作用。
参考文献:
[1]Bischoff SC.Quercetin:potentials in the prevention and therapy of disease[J].Curr Opin Clin Nutr Metab Care,2008,11(6):733-740.
[2]Stefek M,Karasu C.Eye lens in aging and diabetes:effect of quercetin[J].Rejuvenation Res,2011,14(5):525-534.
[3]王英敏.再灌注期间应用槲皮素对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究[D].石家庄:河北医科大学学位论文,2011.
[4]王兴红,郑亚萍,李海霞.槲皮素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(4):266-270.
[5]刘新义,李健和,向大雄,等.聚乙二醇化葛根素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].中草药,2013,44(3):327-330.
[6]杨建业,张迎春,唐俊明,等.大鼠心肌缺血再灌注后心功能变化与心肌梗死面积的相关性分析[J].实验动物与比较医学,2008,28(1):4-9.
[7]张宝红.药物预处理与缺血预处理对心肌缺血再灌注损伤保护作用的实验研究[D].太原:山西医科大学学位论文,2003.
[8]Goldmann BU,Rudolph V,Rudolph TK,et al.Neutrophil activation precedes myocardial injury in patients with acute myocardial infarction[J].Free Radic Biol Med,2009,47(1):79-83.
[9]Baxter GF.The neutrophil as a mediator of myocardial ischemia-reperfusion injury:time to move on[J].Basic Res Cardiol,2002,97(4):268-275.
[10]Saeed SA,Waqar MA,Zubairi AJ,et al.Myocardial ischaemia and reperfusion injury:reactive oxygen species and the role of neutrophil[J].J Coll Physicians Surg Pak,2005,15(8):507-514.
[11]吴志峰,余伯阳,朱丹妮,等.大鼠心肌缺血再灌注模型中中性粒细胞与心肌损伤程度的相关性研究[J].中国药科大学学报,2002,33(3):231-233.
[12]Al-Amran F,Shahkolahi M.Oxytocin ameliorates the immediate myocardial injury in rat heart transplant through downregulation of neutrophil-dependent myocardial apoptosis[J].Transplant Proc,2013,45(6):2506-2512.
[13]Pietruczuk M,Pietruczuk A,Pancewicz S,et al.ICAM-1:structure,biological role and clinical significance[J].Pol Merkur Lekarski,2004,17(101):507-511.
[14]Kukielka GL,Youker KA,Hawkins HK,et al.Regulation of ICAM-1 and IL-6 in myocardial ischemia:effect of reperfusion[J].Ann N Y Acad Sci,1994,723:258-270.
[15]Long EO.ICAM-1:getting a grip on leukocyte adhesion[J].J Immunol,2011,186(9):5021-5023.
[16]崔世涛,葛奎,徐兵,等.抗细胞间黏附分子-1抗体对心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].中华实验外科杂志,2008,25(1):86-88.
[17]唐旭东,姜建青,赁常文,等.中性粒细胞在心肌缺血再灌注中ICAM-1表达及核转录调控的实验研究[J].西南国防医药,2002,12(1):17-20.
[18]Benson V,McMahon AC,Lowe HC.ICAM-1 in acute myocardial infarction:a potential therapeutic target[J].Curr Mol Med,2007,7(2):219-227.
[19]Diaz-Meco MT,Moscat J.The atypical PKCs in inflammation:NF-κB and beyond[J].Immunol Rev,2012,246(1):154-167.
[20]Abe J.Role of PKCs and NF-κB activation in myocardial inflammation:enemy or ally[J].J Mol Cell Cardiol,2007,43(4):404-408.
[21]杨锐,王芬珍.在体大鼠心肌缺血再灌注损伤中NF-κB p65与AngⅡ表达的变化[J].心电与循环,2014,33(2):123-126,142.
[22]Li C,Gao Y,Tian J,et al.Sophocarpine administration preserves myocardial function from ischemia-reperfusion in rats via NF-κB inactivation[J].J Ethnopharmacol,2011,135(3):620-625.
Study of protective effect and the mechanisms of quercetin on myocardial ischemia/reperfusion injury
LI Dong-meia,ZHANG Yuan-yuana,XU Lia,CAO Jun-pinb*
(a.Department of Pharmacy,b.Department of Sterilization and Supply,General Hospital of Armed Police Forces,Beijing 100039,China)
[Abstract]ObjectiveTo investigate the protective effect and the mechanisms of quercetin (QU) on myocardial ischemia/reperfusion (MI/R) injury.MethodsRat model of MI/R injury was established by coronary artery ligation for 30 min followed by 120 min reperfusion.The rats were divided randomly into 5 groups (n=10): sham group,model group,QU groups (25,50,100 mg/kg).QU was orally administered once daily since 7 d before operation.The area of myocardial infarction was recorded after reperfusion.The myocardial ICAM-1 and NF-κB activities were detected by immunohistochemistry.The MPO activity in heart homogenate was detected.ResultsThe area of myocardial infarction in QU (50,100 mg/kg) groups was reduced respectively,there being significant difference between QU (50,100 mg/kg) groups and model group (P<0.05).The MPO activity in QU groups was lower than that of model group (P<0.05,P<0.01).The ICAM-1 positive rates of heart in QU groups decreased (P<0.05,P<0.01).The NF-κB positive rates in QU (50,100 mg/kg) groups decreased,and there were significant differences between QU (50,100 mg/kg) groups and model group (P<0.05).ConclusionQU pretreatment can protect against MI/R injury by the inhibition of neutrophil infiltration and down-regulation of ICAM-1 and NF-κB expression.
Key words:Quercetin;Myocardial ischemia/reperfusion injury;Neutrophil;ICAM-1;NF-κB
收稿日期:2015-07-14
DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201604005