肠道病毒71型与天然免疫系统相互作用的研究进展

张小龙，李琦涵

中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所，云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，昆明 650118



·综述·

肠道病毒71型与天然免疫系统相互作用的研究进展

张小龙，李琦涵

中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所，云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，昆明 650118

摘要：肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)为小RNA病毒科肠道病毒属成员，是引起手足口病的主要病原体之一。EV71流行广泛，其感染可引发中枢神经系统疾病，并造成重症手足口病，给公共卫生安全带来极大挑战。EV71的致病机制与病毒和宿主天然免疫系统的相互作用关系密切，涉及病毒逃逸干扰素反应、病毒抑制核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信号通路及病毒与天然免疫细胞相互作用等多个环节。本文就近年来EV71与宿主天然免疫系统相互作用的研究进展进行综述。

关键词：肠道病毒71型；天然免疫；手足口病

肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是引发手足口病的主要病原体之一，主要感染5岁以下婴幼儿。其感染常引起发热和手、足、口等部位溃疡及疱疹，某些情况下还可侵犯呼吸系统、中枢神经系统(central nervous system，CNS)而引起无菌性脑膜炎、肺水肿、心肌炎、心肺衰竭等症状，是引发重症手足口病的最主要病原体[1-2]。近年来，我国大陆地区EV71的持续流行严重影响了儿童健康，亦给社会和患儿家庭带来了巨大的经济负担[3]。目前已开发出针对EV71的预防性灭活疫苗，Ⅲ期临床试验显示其对EV71感染引起的手足口病具有良好的保护性[4-5]。但仍没有针对EV71的特异性抗病毒药物，对EV71感染引发的重症手足口病也仅限于支持治疗，而重症病例存活后可能出现不良预后，如神经系统后遗症[6-7]及学习和认知障碍[8-9]。因此，研制针对EV71感染的特异性抗病毒药物具有重要意义。

特异性抗病毒药物的研发依赖于对病原体致病机制的了解。天然免疫系统是机体抵抗病原体感染的第一道防线，更是特异性免疫反应感知病原体入侵的前哨。宿主利用天然免疫系统来防止EV71感染，而EV71亦进化出多种能力来逃避相应的抗病毒反应，这些过程涉及许多复杂的病毒与宿主相互作用，对这些相互作用的了解有助于深入认识病毒的致病机制。

1EV71抗宿主Ⅰ型干扰素反应

Ⅰ型干扰素反应是宿主免疫反应的第一道防线，具有重要的抗病毒能力。通常病毒感染宿主细胞后，天然免疫系统通过模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)如Toll样受体3/7/8/9(Toll-like receptors 3/7/8/9，TLR3/7/8/9)、维A酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)及黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5)识别病毒RNA，并通过一系列信号转导作用启动Ⅰ型干扰素表达[10]，Ⅰ型干扰素进而诱导大量效应因子表达以改变细胞内环境，使其不利于病毒复制，同时促进病毒抗原向适应性免疫细胞的呈递作用，并激活T细胞以启动特异性免疫反应[11-13]。体内外实验表明，Ⅰ型干扰素具有抗EV71感染的能力[14-16]，但EV71感染的细胞时常不能有效表达Ⅰ型干扰素[17-19]，尤其是在脑组织和消化道组织细胞中[20]。EV71感染的同时也抑制了Ⅰ型干扰素效应基因的表达[21]。近年来积累的研究资料表明，EV71利用多种蛋白在多个环节上对宿主细胞Ⅰ型干扰素抗病毒反应进行的攻击是造成以上现象的主要原因(图1)。

图1肠道病毒71型抑制宿主细胞Ⅰ型干扰素反应

Fig.1Inhibition of type Ⅰ interferon response in host cells by EV71

3C蛋白是EV71的一个非结构蛋白，其与病毒其他蛋白共同表达于受感染细胞的细胞质中。EV71 3C蛋白对病毒复制具有重要作用[22-23]，也在多个不同途径中参与病毒与宿主细胞的相互作用。在EV71感染的神经元中，3C蛋白诱导宿主细胞凋亡[24]。小鼠模型感染实验显示，3C蛋白可显著抑制小鼠体内Ⅰ型干扰素的表达[20]。TLR3感知细胞中的病毒双链RNA，TLR7则感知病毒单链RNA，它们激活共同的下游转录因子——干扰素调节因子7(interferon regulatory factor 7，IRF7)，因此IRF7在Ⅰ型干扰素应答过程中扮演重要角色。3C蛋白可结合并断裂TLR3及TLR7信号通路中的转录因子IRF7，抑制Ⅰ型干扰素基因表达[25]；还能通过特异性结合TLR3的下游信号传递蛋白——含Toll/白细胞介素1受体结构域能诱导β干扰素的接头分子(Toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter-inducing interferon β，TRIF)，诱导TRIF断裂，使其失去激活Ⅰ型干扰素基因表达的能力[26]。

RIG-1作为不同于TLR的另一种PRR，负责在细胞质中感知细胞内的病毒双链RNA结构，并通过下游信号传递蛋白——线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS；也称IPS-1)传递Ⅰ型干扰素激活信号。EV71 3C蛋白可与RIG-1蛋白N端结合，封闭其与MAVS结合的结构域，使RIG-1不能有效募集和激活MAVS，从而阻断抗病毒信号传递[18]；另有研究显示，EV71 3C蛋白可直接催化RIG-1蛋白断裂[27]。

MDA5与RIG-1同属RIG-1样受体家族，是与RIG-1有着类似功能的PRR，可感知细胞内的双链病毒RNA。MDA5主要负责识别长片段的病毒双链RNA，并通过MAVS激活IRF3/7，进而诱导Ⅰ型干扰素产生。EV71可通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)依赖途径断裂MDA5蛋白，阻断其对下游因子IRF3的激活及Ⅰ型干扰素的表达[19]。Feng等研究则发现，EV71 与脊髓灰质炎病毒及柯萨奇病毒A3型(coxsackievirus A3，CA3)共同利用表达于宿主细胞质中的非结构蛋白2A，以非caspase依赖途径断裂MDA5[27]。这两个相互矛盾的研究结果可能预示着EV71在不同的生理条件下利用了不同的途径来干扰MDA5介导的Ⅰ型干扰素激活信号传递。

MAVS是Ⅰ型干扰素信号传递通路中关键的信号传递蛋白，其向下游传递胞质PRR RIG-1和MDA-5的激活信号，进而引发Ⅰ型干扰素表达，很多病毒正是以MAVS为攻击靶点来逃逸宿主细胞的抗病毒反应。EV71 2A蛋白能在MAVS的3个不同甘氨酸残基位点特异性断裂MAVS，并将断裂的MAVS蛋白从线粒体外膜上释放到细胞质中，使其不能激活下游的Ⅰ型干扰素基因转录因子IRF3，从而阻止感染EV71的宿主细胞表达Ⅰ型干扰素[17]。多种肠道病毒均被证实利用了与此相同的策略来干扰宿主的抗病毒反应[27]。

虽然EV71 2A及EV71 3C蛋白对细胞Ⅰ型干扰素信号通路进行了多环节攻击，但并未完全抑制宿主Ⅰ型干扰素的表达。在EV71感染的多种细胞中，干扰素β(interferon β，IFN β)的转录水平仍有一定程度上调[21,28-29]。然而，EV71对Ⅰ型干扰素下游应答通路同样具有抑制作用。当EV71感染横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RD)细胞时，EV71 2A蛋白能下调干扰素α受体1(interferon α receptor 1，IFNAR1)表达，减少其对下游转录因子STAT的磷酸化，抑制Ⅰ型干扰素激活下游效应因子[28]。当EV71感染人胚肺成纤维细胞(MRC-5)和RD细胞时，EV71可通过负向调控IFNAR1的下游信号分子JAK1，导致JAK1和酪氨酸激酶2(tyrosine kinase 2,TyK2)无法磷酸化，从而关闭Ⅰ型干扰素刺激基因(interferon-stimulated gene，ISG)的应答[29]。

EV71在利用病毒自身组分来对抗宿主Ⅰ型干扰素反应的同时，还可调动宿主细胞的因子来逃避天然免疫反应。EV71感染人胶质母细胞瘤细胞(SF268)时，细胞中的NEDD4蛋白家族成员NEDD4L表达量增加，且NEDD4L对EV71在HeLa细胞中的复制具有促进作用。EV71利用了NEDD4L对IFN-β基因转录的负向调控作用，抑制受感染细胞的IFN-β分泌[30]。

虽然EV71可阻断TLR3/7、MDA5和RIG-1等识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的PRR所介导的抗病毒反应，但宿主细胞还可借助损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)的PRR来抵抗EV71感染。EV71感染可引起上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞和神经细胞凋亡[24,31-33]，同时死亡细胞释放的DNA作为一种DAMP信号被细胞胞内体膜上的PRR成员 TLR9识别，进而激活NF-κB信号通路，并最终诱导细胞产生IFN-α以介导抗病毒反应[34]。

对脊髓灰质炎病毒的研究显示，组织中Ⅰ型干扰素及其下游效应因子的表达水平是组织细胞对脊髓灰质炎病毒易感性的重要决定因素，Ⅰ型干扰素抗病毒反应极大限制了脊髓灰质炎病毒的复制，而脊髓灰质炎病毒也可能利用了少数个体Ⅰ型干扰素抗病毒反应缺陷的漏洞而成功入侵其CNS[35]。EV71与脊髓灰质炎病毒同属肠道病毒，其对宿主细胞Ⅰ型干扰素反应的抑制作用，尤其是在脑组织及胃肠道组织中的有效抑制，是否与其组织向性及致病机制相关，值得进一步研究。

2EV71抗宿主Ⅱ型干扰素反应

动物及临床试验显示，EV71感染可诱导体内IFN-γ水平显著上升[15,20,36-38]，IFN-γ受体敲除小鼠实验表明，IFN-γ具有限制EV71感染的特性[15,39-40]，但EV71可利用2A和3D蛋白调控并逃避细胞的IFN-γ抗病毒反应。在不降低细胞IFN-γ受体表达的情况下，3D和2A蛋白均通过影响IFN-γ应答通路中的转录因子STAT1来干扰细胞IFN-γ应答反应。其中EV71 3D蛋白在转录和翻译水平降低STAT1表达，并阻止STAT1蛋白第701位酪氨酸残基磷酸化，从而影响其进入细胞核激活下游效应因子IRF1表达的能力[15]；EV71 2A蛋白则通过阻止STAT1蛋白第727位丝氨酸残基磷酸化，进而影响STAT1蛋白的二聚化及STAT1二聚体的稳定性，以此消除其激活STAT1蛋白促进IRF1表达的能力[15]。因此，即使感染EV71的宿主细胞增加了IFN-γ表达量，但由于其下游效应因子的激活被EV71 2A及3D蛋白共同阻断，弱化了IFN-γ调动细胞抗病毒反应的能力，从而使EV71逃逸IFN-γ反应，在受感染细胞中成功复制并扩散。但该过程为体外细胞实验所观察到，在EV71感染者体内，尤其是在发展为重症病例的患者体内是否存在相同的过程，仍值得进一步探究。

3EV71与NF-κB信号通路

NF-κB信号通路是细胞应答外界刺激的重要途径，其感知150种以上外界刺激并相应调节150种以上基因的转录活性[41]。多种病毒及细胞应答病毒刺激的产物可激活该通路，且该通路可产生多种与病毒感染相关的细胞因子、免疫信号分子等，因此NF-κB信号通路在宿主细胞抗病毒感染的免疫反应中扮演着重要角色。

在宿主细胞中，EV71利用多条途径阻断细胞NF-κB通路中的活化信号传递。EV71 2C蛋白通过结合p65蛋白的IPT结构域来干扰p65/p50蛋白二聚体的形成，从而阻止NF-κB信号通路激活[42]；EV71 2C蛋白还可结合NF-κB 抑制蛋白激酶β(inhibitor of NF-κB kinase β，IKKβ)并阻止其磷酸化，使IKKα/IKKβ/IKKγ复合体不能激活下游NF-κB，进而阻断肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)对NF-κB信号通路的激活[43]。由于多种受体分子通过IKKα/IKKβ/IKKγ复合体向NF-κB传递激活信号，因此2C蛋白对该“瓶颈”分子的抑制作用可能影响除TNF-α以外的更多刺激信号对NF-κB的激活。

EV71 3C蛋白也参与对NF-κB信号通路的抑制。3C蛋白通过断裂NF-κB通路信号传递蛋白TAK1、TAB1、TAB2和TAB3，破坏TAK1蛋白复合体，使其无法激活下游的NF-κB[44]。EV71 3C蛋白能特异性断裂TLR3的下游信号传递蛋白TRIF，而TRIF不仅参与Ⅰ型干扰素表达的信号传递，也参与NF-κB信号传递，因此3C蛋白对TRIF的断裂作用同样抑制了NF-κB基因的激活[26]。

EV71利用其非结构蛋白2C和3C在不同环节共同抑制NF-κB激活信号的传递，但NF-κB信号通路下游效应因子白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)的表达在EV71感染时显著上升[20,26,37,45]，提示细胞可能利用其他信号传递通路来激活促炎性因子IL-6的表达。最近研究显示，在人肠道组织上皮细胞中，EV71感染激活了丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路中的细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase 1/2，ERK1/2)及c-Jun氨基末端激酶1/2(c-Jun N-terminal kinase 1/2，JNK1/2)信号分子，并触发了与NF-κB信号通路间的交互作用，从而诱导IL-6等促炎性因子的表达[46]。在未成熟树突细胞(dendrtic cell，DC)中，EV71感染则激活MAPK信号通路中的JNK1/2和p38/MAPK分子，并诱导了IL-6产生[47]。EV71感染既可直接作用于NF-κB信号通路，阻断其信号传递，又可从旁路途径激活该通路，进而诱导高水平的IL-6表达，显示了EV71与宿主细胞相互作用的复杂性。

4EV71与天然免疫细胞

DC是体内功能最强的专职抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)，其摄取抗原并加工呈递给T细胞，以激活初始T细胞的增殖与分化，是介导抗病毒感染的重要天然免疫细胞。DC在执行其免疫功能的过程中需经历一个功能性成熟的过程，只有功能性成熟的DC才能诱导抗原特异性T细胞的产生，而未成熟的DC则有可能诱导对特异抗原的免疫耐受[48]。DC的成熟过程涉及众多基因的转录调节。多项研究显示，Ⅰ型干扰素控制着DC的转录调节过程，是刺激DC成熟必不可少的因子[11,49-50]。EV71可感染人类未成熟DC[38,47,51]，并诱导受感染DC中IFN-β表达量上升，但未诱导IFN-α表达量上调[38]，这是否影响DC的功能性成熟仍未知。

早期研究发现EV71可利用DC-SIGN分子作为受体进入未成熟DC中，促进DC的表型成熟及对T细胞的刺激[51]；而以后研究则发现DC利用其细胞表面的DC-SIGN分子黏附EV71颗粒，并促进EV71对其他易感细胞的感染[52]。DC既协助了EV71扩散，又激活了特异性免疫反应，其在EV71感染过程中似乎扮演着双重角色。但以上研究均为体外实验，且未明确区分具有不同特性的DC亚型，因此有必要进行更系统更深入的体内实验来明确DC在EV71感染中所扮演的角色。

EV71具有感染人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的能力[53]，进一步的研究确认EV71可感染CD14+细胞，并在CD14+细胞中复制。EV71对CD14+细胞的感染可能导致其由呼吸道或肠道黏膜向其他靶器官扩散。同时，EV71感染的CD14+细胞可刺激T细胞分裂，并在体内诱导针对EV71的特异性抗病毒反应[54]。CD14+细胞有两类：单核来源的DC和单核-巨噬细胞。体外实验表明，EV71可感染人巨噬细胞并在其中有效复制[55]。巨噬细胞是另一种重要的专职APC。最近研究指出，当EV71感染幼鼠时，巨噬细胞向恒定型自然杀伤T细胞(invariant nature killer T cell，iNKT细胞)呈递抗原和共刺激信号并激活iNKT细胞，活化的iNKT细胞则阻止EV71向幼鼠CNS扩散。对于适应性免疫系统还未发育完全的幼鼠而言，由巨噬细胞和iNKT细胞介导的保护作用对其抵抗EV71感染具有重要意义[56]。

天然免疫细胞是天然免疫应答的主要成分，是感应及清除病原体的功能执行者，更是启动特异性免疫反应的开关。天然免疫细胞的行为很大程度上决定了机体的特异性免疫系统是否对病原体产生应答，以及应答的程度和类型。目前，针对EV71与天然免疫细胞相互作用的研究不多，尤其缺乏深入的体内研究。全面认识两者相互作用过程必将为了解EV71致病机制提供有力的支持。

5结语

EV71预防性疫苗的出现为控制EV71引起的手足口病带来了希望，但EV71流行的广泛性、引发重症手足口病的能力，以及重症手足口病的不良预后等现实迫切需要寻找特异性的抗EV71药物及疗法。近年来，由于技术的进步及关注度的提高，EV71感染机制的研究取得了可喜的进步。研究提示，EV71与宿主天然免疫系统间存在复杂的相互作用，宿主细胞具有多种对抗病毒感染的机制，而EV71则进化出许多途径来逃避宿主细胞的攻击。虽然人们已意识到EV71的致病机制与其逃避天然免疫系统的抗病毒反应有关，但EV71与天然免疫反应的相互作用如何影响特异性免疫反应、个体对EV71的易感性及抵抗能力由什么决定、其组织向性涉及哪些因素、其通过什么途径感染CNS，以及决定其病理表现的因素是什么，这些问题还远未被阐释清楚，给治疗性药物的研发带来了挑战。因此，应在现有研究成果的基础上继续深入了解EV71的致病机制，并最终清除EV71给人类带来的危害。

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Progress on interactions between enterovirus 71 and innate immunity

ZHANG Xiaolong,LI Qihan

Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development on Severe Infectious Disease;Institute of Medical Biology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Kunming 650118,China

Abstract:Enterovirus 71(EV71)is a pathogen for hand,foot and mouth disease(HFMD),and its prevalence is a great challenge to public health.Pathogenesis of EV71 is closely related to a panel of host innate immune responses,such as escape of interferon response,suppression of nuclear factor κB(NF-κB)signaling pathway and interactions between virus and innate immune cells.This review focuses on the new progress on interactions between EV71 and host innate immunity.

Key words:Enterovirus 71;Innate immunity;Hand,foot and mouth disease

基金项目：北京协和医学院“协和青年基金”(3332015051)

通信作者：李琦涵

Corresponding author.LI Qihan,E-mail：liqihan@imbcams.com.cn

(收稿日期：2015-12-29)