生长抑制因子4在人胃癌中的表达及其意义

程海燕，沈哲，陈卫昌，严苏

（1.绍兴第二医院　消化内科，浙江　绍兴　312000；2.苏州大学附属第一人民医院　消化内科，江苏苏州　215006）



生长抑制因子4在人胃癌中的表达及其意义

程海燕1，沈哲1，陈卫昌2，严苏2

（1.绍兴第二医院消化内科，浙江绍兴312000；2.苏州大学附属第一人民医院消化内科，江苏苏州215006）

［摘 要］目的：探讨多种人胃癌细胞株中及胃癌组织中生长抑制因子4（ING4）的表达及其意义。方法：体外培养3种分化不同的胃癌细胞MKN-1（高分化）、SGC-7901（中分化）、BGC-823（低分化）以及人胃黏膜细胞GES-1，收集绍兴第二医院病理科40例原发胃癌患者的石蜡标本。以RT-PCR、Western Blot法分别检测4种细胞株ING4 mRNA及其蛋白表达水平。免疫组织化学法检测胃癌组织及癌旁组织中ING4蛋白表达情况。结果：SGC-7901、BGC-823组中ING4 mRNA及其蛋白表达水平较MKN-1、GES-1组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），BGC-823组中ING4 mRNA及其蛋白表达水平较SGC-7901组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），MKN-1组与GES-1组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。胃癌组织中ING4表达阳性率明显低于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：ING4作为抑癌基因参与了胃癌的发生，且与胃癌分化程度有关。

［关键词］生长抑制因子4；胃癌细胞系；反转录PCR；蛋白质印迹法；免疫组织化学法

生长抑制因子4（inhibitor of growth family member4，ING4）是由Shiseki等人发现的生长抑制因子家族的新成员，它是一种重要的抑癌因子。目前研究认为，ING4属胞内蛋白，在人类正常组织中均有表达，而在多数肿瘤中出现转录水平下降［1-2］。本实验主要检测ING4 mRNA及其蛋白在不同分化的胃癌细胞及胃癌组织中的表达水平，探讨其可能的表达机制及临床意义。

1　材料和方法

1.1材料 胃癌细胞MKN-1（高分化）、SGC-7901（中分化）、BGC-823（低分化）以及人胃黏膜细胞GES-1均为苏州大学细胞与分子生物学教研室惠赠。收集绍兴第二医院病理科40例原发胃癌患者的石蜡标本，依照病理科提供的资料进行癌组织及癌旁组织分类，患者年龄40～84岁。RPMI1640培养基购自GIBCO公司，ING4、β-actin引物均由南京金斯瑞生物科技公司合成，ING4一抗购自北京华夏远洋科技有限公司，二抗购自北京博奥森生物技术有限公司，免疫组织化学染色试剂盒购自迈新生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养：不同细胞分别培养于含10%小牛血清的RPM1640培养液，培养条件为5% CO2，37 ℃，细胞接种在培养瓶后，分别收集处于对数生长期的细胞4×106个，将实验分为GES-1、MKN-1、SGC-7901、BGC-823组。

1.2.2RT-PCR检测ING4 mRNA表达：用Trizol一步法提取各组细胞总RNA。4 μg无DNA的总RNA反转录（mRNA至cDNA），PCR反应在25 μL反应体系中进行。该体系含有cDNA 2.0 μL，dNTPs（10 mmol）0.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL，ING4及β-action的上、下游引物（由primer 5软件设计，南京金斯瑞生物科技公司合成）各0.5 μL，Taq酶（5 U/μL）0．2 μL。扩增基因的引物序列：ING4上游引物序列5’-GCGTCG ACATGGATGATGGGATGTATTTGGAAC-3’，下游引物序列为5’-GCAAGCTTCTATTTCTTCCGTTCTTGGGAG-3’，扩增片段248 bp。用β-actin作为内参照，上游引物为5’-GGGAAATCGTGCGTGACATT-3’，下游引物序列为5’-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’，其预测的产物长度为183 bp。PCR扩增的条件均为94 ℃预变性5 min，继而95 ℃ 20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35个循环，72 ℃延伸7 min。PCR产物在含10 mg/mL 2.5 μL溴化乙锭的琼脂糖凝胶中进行电泳分离，然后用凝胶成像分析仪开始摄像分析。最后用UVISOFT软件处理数据，将目的条带与内参条带的平均灰度之比作为目的基因表达的相对含量。

1.2.3Western Blot检测ING4蛋白表达：4组各取5×105个细胞，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，取40 μg总蛋白制样，经SDS/PAGE凝胶电泳，然后转膜，用TBST配制的5%脱脂奶粉进行封闭，再用l︰1 000稀释的一抗37 ℃摇床孵育1 h以上，l︰10 000稀释的二抗室温孵育3 h，将膜放入盛有TBST的平皿中进行洗膜，化学发光试剂温浴20 min后曝光、显影和定影，对结果进行吸光度扫描分析（明基5000扫描仪），与对照组结果进行对比。

1.2.4免疫组织化学染色检测胃癌组织中ING4蛋白的表达：将40例胃癌组织及癌旁组织的蜡块，进行ING4抗体的免疫组织化学检测。具体步骤参照酶底物显色剂（AEC-0037）说明书进行。在×40视野下观察标本。ING4蛋白阳性表达为细胞核呈棕褐色或深棕色颗粒。

1.3统计学处理方法 采用SPSS17.0软件进行统计分析。数据以±s或百分率（%）表示，率的比较采用卡方检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1RT-PCR检测各组细胞ING4 mRNA的表达 GES-1组、MKN-1组、SGC-7901组、BGC-823组细胞ING4 mRNA平均表达强度分别为：0.46±0.15、0.44± 0.11、0.32±0.08、0.23±0.04，随着胃癌细胞的分化程度降低、恶性程度升高，ING4 mRNA表达逐渐下降，其中BGC-823组、SGC-7901组分别与GES-1细胞组比较ING4 mRNA表达强度明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），MKN-1细胞组与GES-1细胞组比较ING4 mRNA表达强度无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）（见图1）。

图1　4种细胞ING4 mRNA表达情况

2.2Western Blot检测各组细胞ING4蛋白的表达 GES-1组、MKN-1组、SGC-7901组、BGC-823组相对灰度比分别为0.56±0.06、0.54±0.05、0.39± 0.03、0.25±0.01，随着胃癌细胞的分化程度降低、恶性程度升高，ING4蛋白表达逐渐下降，其中BGC-823组、SGC-7901组分别与GES-1组比较，ING4蛋白表达强度明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），MKN-1组与GES-1组比较，ING4的蛋白表达强度无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）（见图2）。

图2　4种细胞ING4蛋白表达情况

2.3免疫组织化学检测胃癌组织中ING4蛋白的表达 胃癌组织及癌旁组织中ING4蛋白表达情况见表1。具体评判标准为细胞中充满了棕色颗粒的为阳性结果，其中，棕黄色为+，棕色为++，深棕色为+++，没有棕色颗粒的为阴性结果。结果发现胃癌组织阳性率明显低于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1　免疫组织化学检测ING4蛋白在胃癌组织中的表达（n=40）

3　讨论

胃癌是一种高发生率的恶性肿瘤，发生率居消化道肿瘤的首位。目前国内早癌的发现率仍低下，绝大部分发现时已属中晚期，且手术根治率低，术后5年生存率一直维持在30%左右。因此，探索能够预测胃癌及诊断的敏感指标，是众多学者研究的焦点，其中关于生长抑制因子家族新成员ING4的研究更为热门。

ING4是一种新发现的抑癌基因，它位于染色体12p13.31，包含了8个外显子和7个内含子，有13 000个碱基对，编码248个氨基酸。ING4基因突变或缺失导致肿瘤发生、发展的机制，可能与肿瘤细胞异常增殖、阻滞肿瘤细胞凋亡及促进肿瘤的侵袭、转移等有关［3］。研究发现，ING4在头颈部鳞状细胞癌［4］、非小细胞肺癌细胞株［5］、结肠癌细胞株RKO［6］等多种恶性肿瘤细胞中出现表达明显下降。2013年Zeng等［7］研究发现ING4表达水平的高低与肝癌的恶性程度有关。本研究发现，胃癌中、低分化细胞株中ING4 mRNA及其蛋白表达水平较胃癌高分化细胞株及正常胃黏膜细胞株明显降低；低分化细胞株中ING4表达水平较中分化细胞株又明显降低；而高分化细胞株ING4表达水平与胃正常黏膜细胞株之间无明显差异。这与Shi等［8］研究发现ING4在胃腺癌细胞系表达下降一致，其机制可能是胃癌细胞中ING4下调导致NF-κB激活，有利于胃癌的发生、发展。本研究还发现，胃癌组织中ING4蛋白表达阳性率明显低于癌旁组织。这与钱莉等［9］研究发现ING4蛋白在胃腺癌组织中明显减少的结果相似。

综上所述，ING4在胃癌细胞中低表达，且随着胃癌细胞的恶性程度增高，表达逐渐降低，胃癌组织中ING4蛋白阳性率亦明显低于癌旁组织，证实ING4表达降低与胃癌的发生、发展密切相关。

参考文献：

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［9］ 钱莉， 董晓荣， 李贵玲， 等. 胃癌组织ING4和HIF-1α及VEGF表达的相关性分析［J］. 中华肿瘤防治杂志， 2012， 19 （8）︰ 600-603.

（本文编辑：丁敏娇）

・临 床 经 验・

Expression and significance of ING4 in human gastric cancer

CHENG Haiyan1， SHEN Zhe1， CHEN Weichang2， YAN Su2. 1.Department of Digestion， Shaoxing Second Hospital， Shaoxing， 312000； 2.Department of Digestion， the First Affi liated Hospital of Soochow Medical University， Suzhou， 215006

Abstract：Objective： To study the expression and significance of inhibitor of growth family member 4 （ING4） in many kinds of human gastric cancer cells and gastic cancer tissue. Methods： In the experimental group， there were three different typs of gastric cancer cells， MKN-1 （high differentiation）， SGC-7901 （moderate differentiation）and BGC-823 （low differentiation）. In the control group， there was a normal gastric mucosal cells GES-1. All cell lines were cultured in vitro. The mRNA and protein expression of ING4 were analyzed by RT-PCR and Western blot. Whether there was ING4 protein expression in gastric cancer tissue and adjacent tissue by immunohistochemistry. Results： The mRNA and protein expression of ING4 in SGC-7901 and BGC-823 groups were signifi cantly lower than that in MKN-1 and GES-1 groups. The difference was statistically signifi cant （P＜0.05）. The mRNA and protein expression of ING4 in BGC-823 group were signifi cantly lower than that in SGC-7901 group. The difference was statistically signifi cant （P＜0.05）. But there was no signifi cant different between MKN-1 group and GES-1 group （P＞0.05）. The positive rates of expression of ING4 protein in gastric cancer tissue was signifi cantly lower than that in adjacent tissue， the difference was statistically signifi cant （P＜0.05）. Conclusion： ING4 protein as a tumor suppressor is associated with the development and prognosis of the gastric cancer， which provide theoretical basis for clinical use ING4 gene targeted therapy for gastric cancer in the future.

Key words：ING4； gastric cancer cell line； RT-PCR； Western blot； imunocytochemistry

［中图分类号］R735.2

［文献标志码］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.011

收稿日期：2016-01-18

作者简介：程海燕（1981-），女，江苏盐城人，主治医师，硕士。