银杏叶提取物对非酒精性脂肪性肝病肝组织TGFβ1、NF-κB、FN表达的影响

王家员，樊建霜，吴亮，黄卡特，王蓉蓉

（1.浙江中医药大学附属温州市中医院　中药房，浙江　温州　325000；2.温州医科大学附属第一医院病理科，浙江　温州　325015）



银杏叶提取物对非酒精性脂肪性肝病肝组织TGFβ1、NF-κB、FN表达的影响

王家员1，樊建霜1，吴亮2，黄卡特2，王蓉蓉2

（1.浙江中医药大学附属温州市中医院中药房，浙江温州325000；2.温州医科大学附属第一医院病理科，浙江温州325015）

［摘 要］目的：观察银杏叶提取物（EGB）对糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的影响，并探讨其作用机制。方法：雄性SD大鼠30只随机均分成正常对照组、2型糖尿病组和EGB治疗组。采用高脂饮食加小剂量（30 mg/kg）链脲佐菌素（STZ）诱导2型糖尿病大鼠模型，EGB治疗组给予50 mg・kg-1・d-1的EGB连续灌胃12周。HE染色光镜下观察肝组织的形态学改变；VG染色光镜下观察肝脏组织的纤维化病变；免疫组织化学法检测肝组织核转录因子Kappa B（NF-κB P65）、转化生长因子β1（TGFβ1）、纤维连接蛋白（FN）以及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达；RT-PCR法检测肝组织NF-κB、TGFβ1、FN mRNA表达。结果：糖尿病大鼠肝细胞出现脂肪变性、气球样变、炎症以及肝纤维化等NAFLD的病理变化；免疫组织化学染色结果显示糖尿病大鼠肝组织出现较多的α-SMA阳性表达的活化的肝星形细胞（HSC），NF-κB P65、TGFβ1、FN蛋白表达显著高于正常对照组（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05），部分肝细胞NF-κB P65呈核阳性表达；RT-PCR显示糖尿病大鼠肝组织TGFβ1、FN基因mRNA表达显著高于正常对照组（P＜0.01，P＜0.05）。经EGB治疗后，肝细胞脂肪变性、气球样变及炎症现象得到明显改善，纤维化程度明显减轻；肝组织α-SMA阳性表达的活化的HSC数量明显减少（P＜0.05）；NF-κB P65、TGFβ1、FN蛋白表达明显下降（均P＜0.05）；TGFβ1、FN基因mRNA表达也明显下降（均P＜0.05）。结论：EGB可明显减轻糖尿病大鼠NAFLD的程度，其机制可能与抑制肝脏NF-κB、TGFβ1、FN的表达有关。

［关键词］糖尿病，2型；非酒精性脂肪性肝病；银杏叶提取物；大鼠

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是2型糖尿病主要的并发症，疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）及相关肝硬化和肝细胞癌［1］。Targher等［2］进行了大样本病例研究，发现2型糖尿病并发NAFL率高达69.5%。Dixon等［3］的研究发现，2型糖尿病合并NAFL的患者中约有60%存在着NASH，约有75%的患者存在进展性肝纤维化等。银杏叶提取物（extract of ginkgo biloba，EGB）是由银杏黄酮和银杏内酯组成的制剂，其药理作用主要为清除氧自由基、抑制脂质过氧化、改善微循环等［4］。本实验通过建立2型糖尿病性NAFLD大鼠模型，用EGB进行治疗，观察大鼠肝脏病理变化，检测肝组织的核转录因子Kappa B（NF-κB）、转化生长因子β1（TGFβ1）、纤维连接蛋白（FN）基因mRNA以及蛋白表达水平，探讨EGB治疗NAFLD的作用机制。

1　材料和方法

1．1动物分组及处理 SPF级雄性SD大鼠30只，由温州医科大学实验动物中心提供，动物准字号：SCXK（浙）2015-0004，体质量140～180 g，随机分成正常对照组、2型糖尿病组和EGB治疗组。2型糖尿病组和EGB治疗组喂以高脂饲料（饲料组成：10.0%猪油、20.0%蔗糖、2.5%胆固醇、1.0%胆酸盐、66.5%常规饲料）1个月，诱发胰岛素抵抗。大鼠在禁食12 h后按30 mg/kg腹腔注射链脲佐菌素（STZ，厦门星隆达化学试剂有限公司产品，溶于0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液内，pH=4.0），注射后72 h测空腹血糖，≥8 mmol/L为造模成功［5］。正常对照组腹腔注射等容积枸橼酸缓冲液。造模成功后EGB治疗组按50 mg・kg-1・d-1剂量灌胃EGB（批号：20060325，宁波市中药制药厂），正常对照组及2型糖尿病组灌服等容积0.9%氯化钠溶液，每天1次。EGB治疗组及2型糖尿病组在治疗期间仍喂高脂饮食，正常对照组予普通饮食。3组动物自由进食、饮水，连续12周。实验结束，禁食12 h后，股动脉放血处死大鼠。

1.2血糖、血脂、血胰岛素、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平的测定 分别取上述3组大鼠，股动脉放血处死，取血3 mL，室温凝固约25 min，1 500 r/min离心20 min，分离血清，用日立7600大型生化分析仪检测血葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、ALT、AST水平（试剂盒购自上海海研医学生物技术有限公司），放射免疫法检测血胰岛素水平（试剂盒购自北京中国原子能研究所）。实验步骤严格按说明书操作。

1.3肝脏病理变化检查

1.3.1HE染色及评分标准：取新鲜肝脏组织1块（约10 mm×10 mm×2 mm），置于10%中性甲醛溶液中固定，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，制成厚度为3 μm切片，行HE染色，中性树胶封固。随机选择5个视野（×200），按下列评分标准［1］进行NAFLD活动度积分（NAFLD activity score，NAS）：①肝细胞脂肪变：0分（＜5%）；1分（5%～33%）；2分（34%～66%）；3分（＞66%）。②小叶内炎症（200倍镜计数坏死灶）：0分（无）；1分（＜2个）；2分（2～4个）；3分（＞4个）。③肝细胞气球样变：0分，无；1分，少见；2分，多见。

1.3.2胶原纤维VG染色及评分标准：肝脏组织石蜡切片，常规脱蜡至水，置入VG染液（1%酸性品红溶液︰苦味酸饱和水溶液=1︰9临用前混合）中染色2～3 min。蒸馏水速洗，迅速脱水或晾干。透明，封固。结果判定：胶原纤维呈红色，肝细胞呈黄色。随机选择5个低倍镜视野（×100），按下列评分标准对肝组织纤维化进行分期［1］：0：无纤维化；1：肝小叶3区窦周或汇管区周围纤维化；2：肝小叶3区窦周合并汇管区周围纤维化；3：桥接纤维化；4：高度可疑或确诊肝硬化。

1.4免疫组织化学IHC染色（Envision二步法） 肝组织石蜡切片，严格按Envision二步法说明书进行操作。NF-κB P65、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）为鼠单抗（稀释浓度为1︰100），TGFβ1为兔多抗（稀释浓度1︰100），FN为兔多抗。一抗及二抗均购于北京中杉金桥生物试剂有限公司。以0.01 mol/L的磷酸缓冲液（PBS）代替一抗进行阴性对照。结果判定：胞浆呈棕黄色为阳性表达。随机选择5个低倍镜视野（×100），应用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件计算NF-κB P65、TGFβ1、FN累积光密度，按下列评分标准评估α-SMA的表达［7］：0：无着色；1：轻度（＜10%）；2：中度（11%～25%）；3：重度（26%～50%）；4：极重度（＞50%）。

1.5半定量RT-PCR 取新鲜肝组织100 mg加1 mL Trizol（购自美国Invitrogen公司），提取大鼠肝组织的总RNA。取2 μg总RNA，用M-MLV（购自Promega公司）反转录酶合成cDNA（20 μL）。取1 μL cDNA作为模板，在Taq DNA聚合酶（购自大连宝生物公司）催化下行目的基因NF-κB、TGFβ1、FN和内参基因RPS16的PCR同管扩增。PCR引物由上海Invitrogen公司合成。PCR引物及反应条件见表1。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳（含0.5 μg/mL Goldview），应用Gel-pro31凝胶分析系统进行分析，以目的基因和内参照基因PCR产物条带累积光密度之比作为目的基因的相对mRNA水平。

表1　大鼠NF-κB、TGFβ1、FN及RPS16引物设计

1.6统计学处理方法 采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。数据以±s表示，计量资料组间两两比较采用单因素方差分析LSD法，计数资料采用秩和检验，取α=0.05作为检验水准。

2　结果

2.1血糖、血脂、血胰岛素、ALT、AST水平 2型糖尿病组大鼠血糖（P＜0.01）、血甘油三酯（P＜0.01）、血胆固醇水平（P＜0.05）、血胰岛素（P＜0.01）、血ALT（P＜0.01）、血AST（P＜0.01）明显高于正常对照组；经EGB治疗后，大鼠血糖（P＜0.01）、血甘油三酯（P＜0.01）、血胆固醇（P＜0.05）、血胰岛素（P＜0.01）、血ALT（P＜0.01）、血AST（P＜0.05）明显低于2型糖尿病组（见表2）。

表2　3组大鼠血糖、血脂、血胰岛素、ALT、AST水平比较（n=10，±s）

表2　3组大鼠血糖、血脂、血胰岛素、ALT、AST水平比较（n=10，±s）

与2型糖尿病组比：aP＜0.05，bP＜0.01

组别　血糖（mmol/L）　甘油三酯（mmol/L）胆固醇（mmol/L）　胰岛素（mU/L）　ALT（U/L）　AST（U/L）正常对照组　6.31±0.42b　1.02±0.10b　2.10±0.85a　15.96±1.76b　33.3±15.85b　108.3±25.59b2型糖尿病组　27.48±1.94b　2.31±0.37b　10.15±3.39b　23.86±0.37b　177.3±66.12b　266.1±56.07bEGB治疗组　16.39±0.42b　0.83±0.24b　6.91±1.56a　16.59±1.35b　93.2±26.56b　220.5±44.70a

2.2肝脏病理变化

2.2.1肝组织HE染色形态学改变：正常对照组大鼠肝细胞正方形或多边形，核居中，胞浆丰富红染，肝索围绕中央静脉放射状排列形成肝小叶结构，肝细胞未见明显脂肪变性、气球样变及炎症细胞浸润，评分为0分；2型糖尿病组大鼠肝细胞明显脂肪变性、气球样变性致肝细胞体积增大后肝索排列拥挤、肝小叶结构不清，肝细胞见多灶点状坏死，小叶内及汇管区见混合性炎症细胞浸润，NAS评分为（2.27± 0.78）分；EGB治疗组肝细胞脂肪变性、气球样变性、坏死以及小叶内、汇管区炎症细胞浸润均有明显减轻，NAS评分为（1.73±0.64）分，与2型糖尿病组相比差异有统计学意义（P＜0.01）（见图1）。

2.2.2肝纤维化病变：VG染色显示正常对照组大鼠仅在肝小叶中央静脉、汇管区动静脉壁有少量红染的胶原纤维，无明显肝纤维增生现象，纤维化评分为0分；糖尿病大鼠肝小叶3区的窦周隙以及严重脂肪变性的肝细胞外、气球样变的肝细胞外出现“鸡爪样”胶原纤维增生，严重者小叶3区增生胶原纤维与汇管区增生胶原纤维相互连接，形成桥接纤维化，甚至汇管区增生的胶原纤维伸入小叶内分割正常肝小叶形成假小叶结构，出现早期肝硬化改变，评分为（1.7±1.5）分，与正常对照组相比差异有统计学意义（u=15，P＜0.01），EGB治疗组显示胶原纤维组织增生程度明显减轻，评分为（0.40±0.70）分，低于2型糖尿病组（u=24，P＜0.05）（见图2）。

图1　各组大鼠肝组织病理变化（HE，×400）

图2　各组大鼠肝组织纤维化病变（VG染色，×100）

2.3肝脏α-SMA免疫组织化学染色结果 生理情况下，α-SMA在肝组织内仅在中央静脉管壁、小叶间静脉管壁及小叶间动脉管壁的平滑肌细胞上表达。激活的肝星形细胞（hepatic stellate cells，HSC）也呈α-SMA阳性表达［6］。正常对照组大鼠肝脏除了中央静脉管壁、小叶间静脉管壁及小叶间动脉管壁的平滑肌细胞呈阳性表达外，未见HSC表达；2型糖尿病组大鼠大多数肝组织内可见α-SMA阳性表达的局灶活化增生的HSC，有少数增生较弥漫，高倍镜下活化的HSC胞浆突起呈星形或棱形，胞浆内脂滴减小，其分布方式与VG染色显示的增生的胶原纤维分布方式基本一致，评分为（1.60±1.35）分；EGB治疗组大鼠活化的HSC数量明显减少，部分大鼠肝脏未见活化的HSC，评分为（0.40±0.70）分，低于2型糖尿病组（P＜0.05）（见图3）。

图3　各组大鼠肝组织α-SMA表达（Invision法，×400）

2.4肝脏组织NF-κB P65、FN蛋白的表达 正常对照组大鼠肝细胞NF-κB P65呈弱阳性表达，定位于胞浆，窦周隙也可见少量表达，糖尿病大鼠肝细胞NF-κB P65表达明显增强，以中央静脉周围的肝细胞胞浆为著，部分肝细胞核亦见表达，其表达量与正常对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；正常对照组大鼠肝细胞TGFβ1表达非常微弱，糖尿病大鼠在中央静脉和汇管区周围的肝细胞胞浆内可见较强表达，与正常对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；FN表达于肝细胞外间质，正常对照组大鼠呈弱阳性表达，2型糖尿病组大鼠表达明显增强（P＜0.05）。EGB治疗后，肝脏组织NF-κB P65、TGFβ1、FN表达均明显减弱，与2型糖尿病组相比差异有统计学意义（均P＜0.05），核表达NF-κB的肝细胞数量也明显减少（见表3，图4-6）。

2.5肝脏组织NF-κB、TGFβ1、NF-B基因mRNA表达正常对照组、2型糖尿病组、EGB治疗组3组大鼠肝脏组织NF-κB基因mRNA表达无显著差异（P＞0.05）；2型糖尿病组TGFβ1、FN基因mRNA表达水平显著高于正常对照组（P＜0.01，P＜0.05），经EGB治疗后，肝组织TGFβ1、FN基因mRNA表达水平较2型糖尿病组明显降低（均P＜0.05）（见表4，图7）。

表3　肝脏组织TGFβ1、NF-κB、FN蛋白表达结果比较（n=10，±s）

表3　肝脏组织TGFβ1、NF-κB、FN蛋白表达结果比较（n=10，±s）

与2型糖尿病组比：aP＜0.05，bP＜0.01

组别　NF-κB　TGFβ1　FN正常对照组　4 206.86±1 430.56a　4 036.85±1 051.12b　5 701.9500± 9 461.75a2型糖尿病组　10 978.77±8 782.59　8 551.00±4 768.68　16 980.3000±11 529.29 EGB治疗组　5 871.87±3 446.22a　5 585.55±2 288.14a　6 660.4534± 2 351.98a

图4　各组大鼠肝组织NF-κB P65蛋白的表达（Invision法，×100）

图5　各组大鼠肝组织TGFβ1蛋白的表达（Invision法，×400）

图6　各组大鼠肝组织FN蛋白的表达（Invision法，×200）

表4　肝脏组织NF-κB、TGFβ1、FN基因mRNA表达结果比较（n=10，±s）

表4　肝脏组织NF-κB、TGFβ1、FN基因mRNA表达结果比较（n=10，±s）

与2型糖尿病组比：aP＜0.05，bP＜0.01

组别　NF-κB mRNA　TGFβ1 mRNA　FN mRNA正常对照组　0.88±0.31　0.4700±0.20b　1.22±0.39a2型糖尿病组　0.86±0.26　0.9100±0.19a　1.85±0.70aEGB治疗组　0.89±0.35　0.6463±0.29a　1.23±0.31a

3　讨论

研究表明，2型糖尿病是NAFLD发生发展的独立危险因素［7］。NAFLD主要组织学病变特点有肝细胞脂肪变性、气球样变、肝细胞溶解性坏死伴炎细胞浸润及肝纤维化［1］。NAFLD发病机制复杂，目前，较为公认的致病因素是胰岛素抵抗。最近的研究表明，NF-κB信号途径（包括IKK激酶复合物、IκB和NF-κB）在胰岛素抵抗发生的分子机制中发挥着重要的作用。在静息状态下IKKS是处于无活性状态，当细胞受到病原微生物、应激作用、细胞因子、氧自由基等刺激时，IKKS活化。活化的IKKS使IκB氨基末端2个保守的Ser位点磷酸化［8］，并降解［9］。IκB的降解导致NF-κB从P50/P65/IκB异源性三聚体中游离而活化，通过核孔复合物转位入核，与特定的NF-κB序列结合引起相应靶基因的转录激活［10］。NF-κB是炎症启动和调节的关键核因子，激活NF-κB可诱导TNF-α、白细胞介素、黏附分子等炎症因子的表达［11］。TGFβ1是目前已知的最强的致肝纤维化细胞因子［12］，其活化因子组织型转谷氨酰胺酶基因的启动子中含有NF-κB的结合位点，NF-κB激活后转位入核，通过与其NF-κB序列结合从而促进TGFβ1表达［13］。HSC又名储脂细胞，生理情况下HSC胞质内富含维生素A和甘油三酯，是人体内储存维生素A的主要场所。活化的HSC不仅分裂增殖，而且转化为肌纤维母细胞，表达α-SMA，大量合成细胞外基质［6］。研究表明，HSC的活化需要细胞因子的作用，TGFβ1是HSC的主要生长因子。FN是肝脏生物基质中一种主要成分，分布于肝脏所有的细胞外间隙中，包括血窦和基底膜，在肝内主要由星形细胞、内皮细胞合成，它是肝纤维化细胞外基质中非胶原蛋白的主要成分。它还可以与细胞外基质的其他成分如胶原、葡萄糖胺聚糖、纤维素结合以及与其他FN分子自联，形成致密纤维网，促进细胞外基质的沉积［14］。

图7　各组大鼠肝组织NF-κB、TGFβ1、FN mRNA的表达

本实验结果发现，糖尿病大鼠表现高血糖、高血脂伴高胰岛素血症，血中肝功能指标AST、ALT明显升高，肝细胞出现脂肪变性、气球样变性、坏死伴炎细胞浸润，甚至小叶3区窦周隙周围及严重脂肪变性的肝细胞外胶原纤维沉积等NAFLD病理特征［1］，说明高脂饮食加小剂量STZ复制的2型糖尿病大鼠并发NAFLD。本实验同时发现，糖尿病大鼠肝组织α-SMA表达的HSC数量明显增多，肝组织TGFβ1、FN mRNA的表达明显升高，NF-κB P65、TGFβ1、FN的蛋白表达明显升高，部分肝细胞因NF-κB活化后易位于核内，呈核NF-κB P65表达。经EGB治疗后，糖尿病大鼠血糖、血脂下降，肝功能以及肝脏的病理改变明显改善，α-SMA表达的HSC数量明显减少，肝组织TGFβ1、FN mRNA的表达明显降低，NF-κB P65、TGFβ1、FN的蛋白表达明显下降，肝细胞核内NF-κB P65表达的细胞数量明显减少，表达强度明显减弱，提示EGB可能通过抑制NF-κB的活性，对多种致炎因子靶基因的激活作用减弱，使糖尿病大鼠胰岛素抵抗及肝细胞的炎症明显减轻，从而改善肝组织的病理变化；另外，EGB通过抑制NF-κB的活性，对靶基因TGFβ1激活减弱，从而使TGFβ1活化HSC的能力减弱，肝合成细胞外基质减少，从而减轻了NAFLD肝纤维化病变。EGB抑制NF-κB活性后，活化的HSC减少，因此，FN的mRNA和蛋白的表达减少，FN合成减少，也是肝纤维化病变减轻的主要原因之一。

综上所述，EGB可减轻糖尿病大鼠NAFLD的病变，其机制可能与其抑制肝组织NF-κB P65、TGFβ1、FN的表达有关。

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（本文编辑：丁敏娇）

The effect of EGB on expression of TGFβ1， NF-κB， and FN in hepatic tissues from diabetic rats with non-alcoholic fatty liver disease

WANG Jiayuan1， FAN Jianshuang1， WU Liang2， HUANG Kate2， WANG Rongrong2. 1.Pharmacy of Chinese Medicine， the Affi liated Wenzhou Chinese Medical Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， Wenzhou， 325000； 2.Department of Pathology， the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015

Abstract：Objective： To observe the effect of extract of ginkgo biloba （EGB） on hepatic tissue from DM rats with non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD）. Methods： Thirty male Sprague-Dauley rats were divided randomly into three groups︰ normal control group， type 2 diabetic group and EGB-treated group. After being fed with high-fat feeding for 4 weeks， the later groups were injected with low dosage strepozotocin （30 mg/ kg） intraperitoneally to induce NAFLD model of type 2 diabetes mellitus. The EGB treated group was gavaged with EGB at the dosage of 50 mg·kg-1·d-1for 12 weeks. The pathologic changes of liver was observed under light microscopy （LM） stained with HE and VG staining respectively. Additionally， the protein expression of NF-κB， TGFβ1， FN， α-SMA were assayed by immunohistochemistry （IHC）， the mRNA expression of TGFβ1，NF-κB， FN from rats livers were assayed by semi-quantitative RT-PCR. Results： Liver specimen from diabetic rats stained by HE and VG showed obvious liver fatty degeneration， ballooning degeneration， dotty necrosis necrosis with accompanying infl ammatory infi ltration and fi brosis. Meanwhile， we discovered that there were a great number of α-SMA reactive hepatic stellate cells in diabetic rats liver tissue. In addition， the protein expression of NF-κB， TGFβ1， FN （P＜0.05， P＜0.01， P＜0.05） and the TGFβ1， FN mRNA expression （P＜0.01， P＜0.05）of diabetic rats livers were significantly higher than that of the normal control group. After treatment withbook=4,ebook=38EGB， the pathological change of liver and proliferation of hepatic stellate cell in diatetic rats relieved （P＜0.05）. Meanwhile， the protein expression of NF-κB， TGFβ1， FN （P＜0.05） and the TGFβ1， FN mRNA expression （P＜0.05） of diabetic rats livers decreased signifi cantly compared with type 2 diabetic group. Conclusion： EGB can relieve NAFLD from diabetic rats. Down regulation of expression of NF-κB， TGFβ1， FN may be involved in it.

Key words：diabetes mellitus， type 2； non-alcoholic fatty liver disease； extract of ginkgo biloba； rats

［中图分类号］R363

［文献标志码］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.008

收稿日期：2015-09-16

基金项目：温州市科技局科研基金资助项目（Y20120010）。

作者简介：王家员（1976-），男，浙江温州人，主管药师。

通信作者：王蓉蓉，副主任医师，Email：hulangwang307@163.com。