重组登革病毒1-4型包膜蛋白EDIII的融合表达和免疫学特性研究

任守凤，刘文权，曹国梅，梁韶晖，潘长旺

（温州医科大学　基础医学院寄生虫学教研室，浙江　温州　325035）



重组登革病毒1-4型包膜蛋白EDIII的融合表达和免疫学特性研究

任守凤，刘文权，曹国梅，梁韶晖，潘长旺

（温州医科大学基础医学院寄生虫学教研室，浙江温州325035）

［摘 要］目的：构建含登革病毒（DENV）1-4型包膜蛋白（E蛋白）EDIII区的融合蛋白，并通过动物实验分析该融合蛋白的免疫机制。方法：通过生物信息学分析获得具有广泛代表性的DENV 1-4型EDIII区的氨基酸序列；将编码DENV 1-4型EDIII区的基因序列通过GS linker进行串联后插入原核表达载体pColdIII的多克隆位点，并将构建的重组质粒pColdIII-EDIII转化至大肠杆菌BL21（DE3）；通过SDS-PAGE及Western blot法鉴定目的蛋白表达，采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。将纯化的蛋白免疫BABL/c小鼠，初次免疫之后再加强免疫2次。通过ELISA法检测血清中的抗体效价和细胞因子的分泌情况来评价其免疫效应。结果：重组蛋白EDIII免疫小鼠后可以诱导产生高滴度的特异性抗体，抗体效价为1︰40 000。抗原刺激小鼠脾淋巴细胞可以诱导Th1和Th2细胞免疫应答。结论：成功表达了含DENV 1-4型E蛋白EDIII的融合蛋白，并通过动物实验证实该融合蛋白能诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答，为DENV四价重组疫苗的研制奠定了基础。

［关键词］登革病毒；包膜蛋白；融合表达；四价疫苗

登革病毒（dengue virus，DENV）是一种单链正义RNA病毒，有4种血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4）［1］，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊在人际间进行传播［2］。感染后主要引起登革热、登革出血热和登革休克综合征［3］。据WHO统计，全世界有超过36亿人生活在登革热流行区，每年感染DENV的人数超过5千万，其中有近3万人死亡［4］。近年来，我国沿海的台湾、福建、广东、广西和云南均有登革热的流行［5］。尤其是2014年，广东省爆发了大规模的登革热疫情，发病人数超过3万例。因此，急需研制一种安全、有效的登革疫苗用于预防登革热。

理想的登革疫苗应该对DENV 1-4型均产生长远的保护。而筛选各血清型中具有广泛代表性EDIII保守序列则是研制DENV 1-4型疫苗的前提。因此，本研究首先通过生物信息学分析获得具有广泛代表性的DENV 1-4型EDIII区的氨基酸序列；并将这些保守的DENV 1-4型EDIII区进行串联表达，为后续制备一种能同时针对DENV各血清型和绝大多数流行株的DENV四价重组亚单位疫苗奠定基础。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1质粒和菌株：原核表达载体pColdIII为本实验室保存。含DENV 1-4型EDIII抗原的重组质粒puc57-EDIII由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。大肠杆菌DH5α和BL21为本实验室保存。

1.1.2实验动物：BABL/c小鼠（6～8周龄，雌性，清洁级）购自温州医科大学动物中心，动物合格证号：SYXK（浙）2015-0009。

1.1.3主要仪器和试剂：限制性内切酶XhoI、XbaI 和T4DNA连接酶等均购自Fermantas公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠二抗购自Fermantas公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Omega公司，酶标仪购自美国Bio-Rad公司；ECL发光剂购自北京天根生化科技有限公司；Ni-NTA螯合亲和层析柱购自Qiagen公司。所用其他化学试剂均为分析纯等级。

1.2方法

1.2.1生物信息学分析：为选取具有广泛代表性的DENV EDIII抗原，我们通过对黄病毒数据库FLAVIdB （http︰//cvc.dfci.harvard.edu/flavi/）收录的1 795条DENV1，1 487条DENV2，1 012条DENV3和407 条DENV4包膜蛋白（E蛋白）分别进行氨基酸序列的比对分析，得到氨基酸保守性在90%以上的DENV 1-4型EDIII区序列作为候选靶抗原序列。

1.2.2重组质粒pColdIII-EDIII的构建和鉴定：利用限制性内切酶XhoI、XbaI对pColdIII质粒和puc57-EDIII质粒进行双酶切，酶切产物经琼脂糖电泳回收并纯化，T4DNA连接酶16 ℃连接过夜，连接产物转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细菌中。氨苄青霉素平板筛选阳性克隆并用通用引物进行PCR鉴定，筛选出其中的阳性克隆。将鉴定正确的对应菌液进一步送测序验证，测序工作由上海华大基因有限公司完成。

1.2.3重组蛋白EDIII的诱导表达和鉴定：挑选测序正确的阳性菌株进行诱导表达，以1︰100的比例接种于10 mL LB/Amp+液体培养基中，37 ℃，250 r/min，振荡过夜；取1 mL新鲜培养的菌液，接种于20 mL LB/Amp+液体培养基中，37 ℃，250 r/min，振荡培养2 h，在菌液A600为0.6时，加入IPTG至终浓度1.0 mmol/L，15 ℃诱导22 h。以不加诱导剂的菌液作对照组。诱导结束后收集菌体，12 000 r/min，离心10 min；用磷酸盐缓冲液（PBS）将菌体重悬，与上样缓冲液混匀，100 ℃加热10 min，进行SDSPAGE电泳检测蛋白诱导表达是否成功。将菌体用PBS重悬超声裂解，然后将超声后的上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳并用鼠抗His-tag抗体为一抗，对应的HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体为二抗，进行Western blot法分析鉴定检测蛋白表达是在上清还是沉淀。结果显示沉淀蛋白表达量比上清高。

1.2.4Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白：将EDIII重组蛋白大量诱导表达，经过超声破碎后收集上清和沉淀，将沉淀用8 mmol/L尿素裂解后收集上清，将收集的上清通过Ni-NTA螯合亲和层析柱纯化，以不同浓度的咪唑洗脱，将各浓度咪唑的洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot法鉴定。对含有纯化蛋白的洗脱液进行透析、浓缩，测定蛋白浓度后于-20 ℃保存备用［6-7］。

1.2.5免疫小鼠：将BALB/c小鼠分为实验组和对照组，每组8只。实验组以重组蛋白EDIII 50 μg稀释于PBS，然后与等量弗氏完全佐剂混合至完全乳化，皮下多点注射免疫BALB/c小鼠（每只200 μL），对照组以PBS免疫小鼠，免疫的途径、方法与实验组相同。于初次免疫后间隔2周再加强免疫2次。并于每次免疫后断尾取血用于抗体效价的检测。末次免疫后的第6周对BALB/c鼠进行眼眶采血，分离血清，并取小鼠脾淋巴细胞进行细胞因子检测。

1.2.6免疫血清中抗体的检测：用纯化的EDIII蛋白包被ELISA板，用倍比稀释的小鼠血清为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，TMB显色液进行显色，抗体效价通过酶标仪测定的450 nm波长的OD值获得，抗体效价通过一抗的稀释比表示。

1.2.7 细胞因子检测：①脾淋巴细胞悬液的制备：将2组小鼠眼眶取血后颈椎脱臼处死，无菌条件下剖开小鼠腹腔取脾，将脾脏放入1 mL RPMI 1640细胞培养液中清洗，将清洗过的脾脏置于400目滤网上，用5 mL注射器内芯轻轻研磨，不断向组织上滴加RPMI 1640细胞培养液，直至组织内绝大部分细胞被分离，将细胞悬液小心加于含有淋巴细胞分离液的15 mL离心管中，细胞悬液要加于淋巴细胞分离液的液面之上，18～22 ℃，400×g离心20 min。离心后，用吸管小心吸出分离液上层（包含淋巴细胞的细胞层）0.5 cm以上的上清液部分并弃去。吸取分离液层及淋巴细胞层置于另一新离心管内。然后加10 mL PBS缓冲液混匀，250×g离心10 min，弃上清，用吸管以5 mL PBS缓冲液重悬所得细胞，250×g离心10 min后弃上清，加1 mL含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬细胞并计数，将脾细胞浓度用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整到1×107/mL。②细胞因子的检测：将脾淋巴细胞悬液稀释到1×106/mL加到96孔板（每孔100 μL），然后加入DENV四价重组蛋白EDIII（5 μg/mL）抗原刺激脾淋巴细胞产生细胞因子，用刀豆素（ConA 5 μg/mL）做阳性对照，培养细胞用的培养液（Media：RPMI 1640 media）做阴性对照，37 ℃培养48 h后收集培养上清，-80 ℃保存备用，测定细胞因子的浓度。

2　结果

2.1生物信息学分析 对黄病毒数据库FLAVIdB收录的1 795条DENV1，1 487条DENV2，1 012条DENV3 和407条DENV4 E蛋白分别进行氨基酸序列的比对分析，得到氨基酸保守性在90%以上的DENV1-4型EDIII区序列作为候选靶抗原序列，见图1。

图1　DENV1-4型EDIII区氨基酸序列的保守性分析

2.2重组质粒pColdIII-EDIII的构建和鉴定 重组质粒pColdIII-EDIII的构建示意图（见图2A）。空质粒pColdIII和重组质粒puc57-EDIII经过限制性内切酶XhoI、XbaI双酶切之后，将目的基因EDIII用T4DNA连接酶连接到原核表达载体pColdIII获得重组质粒pColdIII-EDIII。重组质粒经过双酶切鉴定，切出目的片段的大小是1 500 bp，与预期的大小一致（见图2B）。测序结果显示目的基因以正确的方向连接于载体，说明重组质粒构建成功。

图2　重组质粒pColdIII-EDIII的构建和鉴定图

2.3重组蛋白EDIII的诱导表达、纯化和鉴定 构建好的重组质粒诱导表达后收菌，经过SDS-PAGE电泳和Western blot分析鉴定检测蛋白表达，其中Western blot检测的一抗是鼠抗His-tag抗体（见图3A-B）。将重组蛋白EDIII大量诱导表达并超声破碎后分别经过SDS-PAGE电泳和Western blot分析，结果显示目的蛋白在在沉淀中含量较高，并且易于纯化，将超声后沉淀处理后，用不同浓度的咪唑溶液洗脱，SDS-PAGE电泳显示目的蛋白主要存在于100 mmol/L咪唑洗脱液中（见图3C），纯化后纯度达90%以上。

图3　重组蛋白EDIII的诱导表达、鉴定和纯化

2.4抗体水平检测及动态观察 不同时间对注射重组蛋白EDIII的8只小鼠断尾取血，分离血清，用间接ELISA法检测抗体IgG产生水平，免疫前血清作对照。结果显示注射了重组蛋白EDIII的小鼠抗体效价随时间延长而不断升高，第3次免疫后达高峰并能维持一段时间，抗体效价为1︰40 000（见图4）。

图4　ELISA法检测抗DENV1-4 EDIII抗体水平图

2.5细胞因子检测 实验组和对照组的脾淋巴细胞在不同刺激物作用下培养48 h后收集上清，测定细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10。与对照组相比，实验组能诱导较高水平的IFN-γ、IL-4和IL-10，分别为40 pg/mL、8 pg/mL和186 pg/mL（见图5），说明重组蛋白EDIII可诱导小鼠产生较强的细胞免疫应答。

3　讨论

DENV感染引起的登革热是热带和亚热带国家和地区的重要公共卫生问题。近年来，随着全球气候的变暖以及全球化带来的人口流动性增加，DENV的暴发和流行变得更为频繁，给人们的身体健康带来了严重的威胁［8］。登革热是由4种基因型相似但抗原性截然不同的血清型DENV引起的，所以理想的DENV疫苗必须能够有效地对抗4种血清型DENV的感染［9］。

图5　ELISA检测细胞免疫应答

E蛋白是DENV的主要结构蛋白，E蛋白能和宿主细胞表面受体相互作用并在病毒入侵过程中起至关重要的作用，还能诱导宿主产生中和抗体［10-11］。E蛋白有3个结构域（DI、DII、DIII），其中DIII结构域含有多个血清型特异的中和表位和宿主细胞受体识别位点，能诱导病毒型特异的保护性中和抗体和血凝抑制抗体的产生［12］。因此，DENV EDIII被广泛认为是候选疫苗的良好抗原。Fahimi等［13］从基因库中筛选出3型DENV不同分离株的EDIII的氨基酸序列，经过序列比对，筛选出序列一致的氨基酸序列作为靶序列并进行重组蛋白的诱导表达，将原核表达的重组蛋白免疫小鼠后获得特异性的抗EDIII蛋白抗体。同时，实验组小鼠脾细胞分泌细胞因子（IFN-γ 和IL-4）的浓度与对照组相比显著增加。结果表明，表达的重组EDIII蛋白是免疫原性抗原，可以诱导针对3型DENV的特异性免疫反应。但是DENV有4种血清型，单一型的重组蛋白不能对其他型的DENV产生免疫保护作用。

目前制备DENV四价疫苗有两种方式，一种是分别制备多个血清型的DENV抗原，并进行混合配伍。如Zhao等［14］研究了一种基于EDIII的四价疫苗，将DENV的2个血清型（血清型1和2；血清型3和4）的EDIII区用甘氨酸-丝氨酸接头（Gly4Ser3）连接串联起来在大肠杆菌中分别表达。然后，这2个二价重组EDIII蛋白等量混合形成四价疫苗候选物MixBiEDIII。混合疫苗的缺点在于其疫苗组分需进行独立制备，且混合的剂量不容易进行质控，增加了其在实际应用上的难度。目前，普遍采用一种将四价抗原进行串联的方法来制备DENV四价疫苗。如Poggianella等［15］设计了一种针对所有4种病毒血清型具有高中和抗体滴度的DNA疫苗，其免疫原性分子是将DENV EDIII融合于IgG的免疫球蛋白H链的二聚CH3结构域，并将EDIII序列的密码子优化，密码子优化后的融合蛋白可以高水平表达，从而诱导强的抗体应答，免疫小鼠产生的血清对每种血清型感染性病毒颗粒产生反应，具有低交叉反应性和交叉中和活性。

但是重组的EDIII抗原存在免疫原性差异，不能有效诱导免疫保护作用。而脂质体蛋白Lipo被认为是一种能够有效提升免疫原性的佐剂，已被广泛应用在肿瘤和病毒疫苗的制备上。如Song等［16］将脂蛋白脂-D1E3（脂-NTER）的胰蛋白酶N-末端片段与重组突变HPV16 E7（rE7m）的蛋白质混合免疫小鼠，能提升抗E7的抗体滴度并抑制肿瘤生长。Chen等［17］选择了4型DENV EDIII作为登革热疫苗候选抗原，并在大肠杆菌系统中表达脂化形式的重组蛋白。在没有外源佐剂的情况下，重组脂化4型DENV EDIII诱导小鼠产生抗体的频率比非脂化形式的高。重要的是，重组脂化4型DENV EDIII免疫的小鼠表现出持久的中和抗体反应，并在攻击后减少了病毒血症的水平。因此，我们认为脂化策略可以应用到DENV的四价串联疫苗的制备。

本研究通过生物信息学分析获得1-4型DENV EDIII的保守氨基酸序列，并将4种血清型DENV EDIII区的基因序列用连接肽链接起来，从而实现一个重组蛋白可以对4种血清型DENV产生免疫保护的目标［18-21］。除此之外，本研究采用冷休克表达载体pColdIII，cspA为启动子，当温度降到至15 ℃时，大肠杆菌生长缓慢，菌体蛋白表达减少，从而提高了目的蛋白的表达效率。选择BL21感受态细胞也有利于目的蛋白的表达，最终获得大量原核表达的重组蛋白，然后超声破碎，将沉淀处理后进行蛋白纯化，纯化后蛋白纯度可达90%以上。由于诱导后沉淀的蛋白浓度比上清浓度高，而且我们也尝试着用上清做纯化，但是纯化后蛋白纯度不高，为了获得高纯度高浓度的重组蛋白，我们选择沉淀进行纯化，并将获得的重组蛋白进行动物免疫试验。动物免疫实验结果显示我们构建的单一四价重组蛋白EDIII可以诱导特异性体液免疫应答，抗体效价可以达到1︰40 000。我们还通过检测细胞因子水平检测了细胞免疫应答水平［22-23］。单一四价重组蛋白EDIII可以诱导高水平的IFN-γ和IL-10。在疫苗研究中，细胞因子检测的重要性在于细胞因子可以激活抗原提呈细胞使宿主处于抗病毒状态，而且在病毒感染过程中细胞因子可以调节体液和细胞免疫应答［24-25］。

总之，本研究通过对免疫小鼠特异性抗体检测，细胞因子检测证明我们构建的单一四价重组蛋白可以诱导特异性的体液免疫和细胞免疫反应，为后续制备新型单一四价重组亚单位疫苗奠定了基础。

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（本文编辑：赵翠翠，丁敏娇）

Fusion expression and immune investigation of recombinant dengue virus EDIII tetravalent protein

REN Shoufeng， LIU Wenquan， CAO Guomei， LIANG Shaohui， PAN Changwang. Department of Parasitology， School of Basic Medical Science， Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325035

Abstract：Objective： To construct dengue virus envelope protein EDIII tetravalent recombinant vaccines and to analyze its immunogenicity. Methods： Firstly， the gene sequences encoding dengue virus type 1-4 envelope protein EDIII were analyzed by bioinformatics methods， and the representative DENV1-4 EDIII was selected and connected by GS linker to obtain chimeric EDIII； Then， the chimeric gene coding EDIII was inserted into the multiple cloning site of the expression vector pColdIII to constructe the recombinant vector pColdIII-EDIII. The constructed pColdIII-EDIII plasmid was transformed into E.coli BL21 cells and induced by IPTG. The recombinant protein EDIII was purifi ed by Ni-NTA affi nity chromatography and confi rmed by SDS-PAGE and Western blot analysis. The purifi ed protein was used to immune BABL/c mice. After boosting twice， to detect the antibody titers in serum and the secretion of cytokines by ELISA to evaluate the immune response. Results： The mice immunized with EDIII could induce specifi c antibodies and the antibody titers was 1︰40 000. The mouse spleen lymphocytes stimulated by antigen could produce cytokine including IFN-r， IL-4， IL-10， which were signifi cantly higher in the experimental group. Conclusion： Our studies indicates that dengue virus envelope protein EDIII tetravalent vaccine can induce specifi c humoral and cellular immune response， and give priority to with the humoral immune response， which laid the foundation for the research of a new type of chimeric tetravalent vaccine in the future.

Key words：dengue virus； envelope protein； fusion expression； tetravalent vaccine

［中图分类号］R373.33

［文献标志码］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.001

收稿日期：2015-12-23

基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（LY13C080001）。

作者简介：任守凤（1989-），女，山东沂源人，硕士生。

通信作者：潘长旺，教授，硕士生导师，Email：wzpcw@sohu. com。