氮胁迫下水稻的激光诱导荧光光谱特性

杨 健，史 硕，2，3*，龚 威，2，杜 霖，4，祝 波，马盈盈，2，孙 嘉

1. 武汉大学测绘遥感信息工程国家重点实验室，湖北 武汉 430079 2. 地球空间信息技术协同创新中心，湖北 武汉 430079 3. 武汉大学资源与环境科学学院，湖北 武汉 430079 3. 武汉大学物理科学与技术学院，湖北 武汉 430072

氮胁迫下水稻的激光诱导荧光光谱特性

杨 健1，史 硕1，2，3*，龚 威1，2，杜 霖1，4，祝 波1，马盈盈1，2，孙 嘉1

1. 武汉大学测绘遥感信息工程国家重点实验室，湖北 武汉 430079 2. 地球空间信息技术协同创新中心，湖北 武汉 430079 3. 武汉大学资源与环境科学学院，湖北 武汉 430079 3. 武汉大学物理科学与技术学院，湖北 武汉 430072

为了指导水稻的田间施肥，解决因过量施肥造成资源的大量浪费以及环境污染，特别是水体富营养化等问题，搭建了基于紫外激光诱导荧光技术的荧光光谱探测系统，以研究水稻叶片的氮水平与荧光强度的相关性。文中先用植物营养测定仪(TYS-3N)测定水稻叶片氮含量和叶绿素含量(样本为水稻分蘖期的倒二叶，采集于中国江汉平原地区)，再用搭建的测量系统采集了不同氮水平的荧光光谱。获得了不同氮水平下水稻叶片的荧光光谱数据库，分析了荧光光谱参数F740/F685(为峰值740，685 nm处的荧光强度比)与氮水平的相关性，发现氮含量的变化对水稻叶片荧光光谱特性影响明显。通过该实验验证了荧光参数的峰值比F740/F685与氮含量呈明显的线性正相关，相关系数(r)为0.871 8，均方根误差(RMSE)为0.076 82。实验表明采用激光诱导荧光光谱探测技术具有快速无损等优点，且有一定潜力用于定量测量植被营养元素的含量，为采用荧光技术对农作物施氮管理提供了支持。

关键字水稻； 氮含量； 激光诱导荧光； 相关性分析

引 言

水稻在我国作为主要的农作物之一，如何提高粮食产量，生产优质粮食不仅是全民关心的问题，而且也是当今科研者研究的一个重点问题。目前，为了提高粮食产量，主要通过不断提高施肥来满足需求。国内外公认的高等植物所必需的营养元素却有16种，它们分别是碳、氢、氧、氮、磷、钾等，而国内农田大多偏施氮肥，并不能完全满足所有营养元素的需求，因此施肥要有限度、有针对性，不是施肥越多越增产，超过合理施肥量的上限就会造成“盲目施肥”等情况。它不仅造成资源的严重浪费、增加生产成本，同时出现水体富营养化以及其他相关环境污染问题； 而且使土壤养份失调，有损于农作物产量并殃及产品质量[1]。据不完全统计我国每年因过度施肥而导致的氮肥浪费金额超过百亿元，因水体富营养化造成的直接经济损失和间接经济损失也过亿。因此，如何合理科学施肥，提高肥料利用率，减轻对环境的压力，是农业持续稳定发展中最为关心的重要问题之一。为此，最初科研工作者通过研究植被的反射光谱，结合相应的植被参数如： 归一化植被指数(NDVI)[2, 3]、叶绿素含量(SPAD)[4, 5]等相关参数对植被的叶绿素含量和施氮水平进行相关研究，但是精度不高，得到结果不佳。后来，美国学者Choppelle等[6-8]对一些植被的激光诱导荧光光谱进行了实验研究分析，研究了施氮水平对荧光光谱的影响，由于实验条件的限制和设置方案问题，实验结果并不理想。国内的潘崎等对激光诱导叶绿素荧光用于绿色植被诊断的可行性进行了研究[9-10]，认为植被叶片的荧光光谱能反应其相应的施氮水平，但是大部分结果都缺少相关参数的统计分析[11-12]。

基于此，我们搭建了激光诱导荧光光谱实验平台，研究了不同施氮水平对水稻荧光光谱特性的影响。利用355 nm的Nd∶YAG固体激光器作为光源，实验样品采用华中农业大学实验栽培田的水稻(位于湖北省随州市均川镇)，获得了水稻叶片在不同氮含量下的激光诱导荧光光谱，并用植物营养测定仪测量所选样本的SPAD值和氮含量。分析了在不同氮含量下荧光光谱的差异，讨论了荧光光谱参数和氮含量的相关性，并在此基础上建立了荧光光谱参数与氮含量的统计关系。从而从实验验证了激光诱导荧光光谱技术可以用于检测水稻叶片氮含量，监测农作物的生长状况，为农作物的施氮方案提供指导。

1 实验部分

1.1 测量原理

当高能量短波光线射入到某些物质上时，由于物质中的荧光团会吸收能量，使电子从基态跃迁至高能级； 但处在高能级的电子极不稳定，就会从高能级跃迁至低能级，从而释放出能量发出荧光，即为荧光效应，整个过程一般会在几个纳秒时间内完成。在外界条件和激发光强度一定的情况下，荧光团的数量越多，被激发到激发态的分子越多，产生的荧光就越强。激发的荧光强度一般表示为[10]

F=Kf0I0(1-e-A)

(1)

式中:F为激发的荧光强度；K是仪器常数；f0是被激发物质的量子效率；I0是激发光强度；A是被激发物质的吸收系数，还与物质的浓度有关。当荧光团的浓度比较低时，上式可以简化为

F=Kf0I0A

(2)

从式(2)可以看出，在其他参量不变的情况下，荧光强度与荧光团浓度成正比。由于氮是叶绿素重要的组成元素，因此不同施氮水平表现为水稻叶片里叶绿素荧光团的含量差异性，从而水稻叶片在受激发时荧光光谱的强度会发生变化[12]。这些特性决定了荧光光谱相关参数可以用于水稻氮胁迫的监测。

1.2 系统和参数

图1为实验系统图，主要由三部分构成： 激发装置、接收部分、数据接收和处理部分。其中紫外激发装置主要由355nm激光器和扩束镜组成； 接收部分由望远系统、355nm截止滤光片、光纤接收器、光谱仪和ICCD阵列组成； 数据接收和处理部分主要通过PC机软件控制完成。基频为1 064nm的激光，经过三倍频模块获得355nm的紫外激光(Surelite，脉冲频率为20Hz，脉冲宽度为5ns，激光单脉冲能量为1.5mJ)，经过准直扩束光学系统后，均匀的入射到水稻叶片表面(距离顶端3cm处)，水稻叶片在激光的照射下产生荧光，荧光信号经由望远镜接收再通过置于望远镜出口处的355nm截止滤光片，通过光纤接收进入光谱仪分光系统，最后ICCD把探测得到的荧光光谱信息传入计算机分析。

Fig.1 Schematic of LIF system

1.3 样品和测量

样本采自华中农业大学实验栽培田的水稻，采集时间为2014年7月15日，水稻品种为甬优4949(V1)，采样时期为分蘖期，采样位置为每株水稻的倒二叶，总共采集了138个样本。将采集到的样本存于零下-20°的冰箱中，并且经过暗室处理，从而保证叶片不再发生光合作用[13]。我们先用植物养分测定仪(TYS-3N，测氮精度： ±5%； 叶绿素范围0.0～99.9 SPAD，叶绿素精度±2 SPAD； 存储量为： 999组数据)对样本的氮含量和SPAD值进行测量，测量位置与激光照射产生荧光位置一致，将测量结果中氮含量值分别为2.5，2.7，3.1，3.3，3.5，3.7，3.9 mg·g-1列于表1中并分别用a，b，c，d，e，f，g，h进行标号； 再用实验室搭建的激光诱导荧光光谱探测系统对各个样本进行荧光光谱探测，荧光光谱范围为360～800 nm，采样间隔为0.5 nm。为了便于对荧光强度进行比较分析，对采集到的光谱进行强度矫正、去噪平滑，并对荧光光谱在460 nm处归一化为1，得到如图2所示的荧光光谱图，它们的相关荧光参数列于表2中。

Table 1 Leaf nitrogen content of paddy and SPAD

Fig.2 Relationship between the wavelength and the relative fluorescence intensity in different N-content

2 结果和讨论

表1是不同氮含量对应的叶绿素SPAD值。可以看出，随着氮含量的增加，SPAD是逐渐递大，呈现一定的线性相关性。从而说明SPAD变化可以反映氮含量的变化。图2是水稻叶片在不同氮含量下的荧光光谱曲线，荧光峰值都出现在460，525，685和740 nm(分别对应不同的荧光团，其中叶绿素等色素荧光团为后面两个峰)，由叶绿素荧光团产生的相对荧光强度差别较大。从结果可以看出随着氮含量的增加荧光强度增大，并没有出现新的峰值，这说明了随着氮含量的变化并不影响叶片内部物质的成份变化，只是叶片中的荧光团含量存在差异，从而验证了叶绿素浓度与荧光强度成正比[10]。因此，可以从荧光的光谱特性变化对水稻氮水平进行评估，为水稻是否需要施氮以及施氮是否过量等情况提供定性的分析。

Table 2 Peak wavelength and relative intensity

Fig.3 Relationship between the leaf N-content of paddy and the ratio of fluorescence intensity

从表2可以看出，荧光光谱参数随着氮含量的增加基本都呈增加的趋势。这就说明了水稻叶片氮含量的变化可以通过荧光光谱参数与其建立相应的变化关系。图3为荧光光谱比值参数(F740/F685)与氮含量线性拟合的结果，可以发现两者具有较高的线性相关性，相关系数(r)为： 0.871 8，均方根(RMSE)为： 0.076 82。从而从实验验证了可以通过荧光光谱分析对水稻氮水平进行检测，指导农作物施肥，减少因盲目施肥导致的资源浪费以及因过量施肥而造成的水体富营养化和其他环境污染问题。

3 结 论

基于实验室搭建的激光诱导荧光探测系统，使用1 064 nm的激光经过三倍频后得到355 nm激发光，通过激光诱导荧光技术获得了水稻在不同氮水平下的荧光光谱特性曲线。结果表明氮含量变化对水稻叶片的荧光光谱特性影响较为明显，且随着氮含量的增加荧光光谱参数呈增大的变化趋势，根据这些差异性有利于利用荧光光谱特性对水稻氮水平的检测。在此基础上，我们对获得的荧光光谱进行校正、去噪、归一化后，发现荧光光谱比值参数与氮含量具有较高的线性相关性(r=0.871 8，RMSE=0.076 82)。从而，从实验上验证了采用激光诱导荧光技术对植被的氮水平进行检测的可行性。因此，利用激光诱导荧光光谱技术掌握植物生长状况与施肥量之间的相互关系，为施肥定量化研究提供参考，为提高土壤肥力以获得优质高产提供保障，同时可以有效降低因过度施肥造成的水体富营养化以及其他相关问题。

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*Corresponding author

Laser Induced Fluorescence Spectrum Characteristics of Paddy under Nitrogen Stress

YANG Jian1, SHI Shuo1, 2, 3*, GONG Wei1, 2, DU Lin1, 4, ZHU Bo1, MA Ying-ying1, 2, SUN Jia1

1. State Key Laboratory of Information Engineering in Surveying, Mapping and Remote Sensing, Wuhan University, Wuhan 430079，China 2. Collaborative Innovation Center of Geospatial Technology, Wuhan 430079, China 3. School of Resource and Environmental Sciences, Wuhan University, Wuhan 430079, China 4. School of Physics and Technology, Wuhan University, Wuhan 430072, China

Order toguide fertilizing andreduce waste of resources as well as enviro nmental pollution, especially eutrophication, which are caused by excessive fertilization, a system of laser-induced fluorescence(LIF) was built. The system aimed to investigate the correlation between nitrogen(N) content of paddy leaf and the fluorescence intensity. We measuredNcontent and SPAD of paddy leaf (the samples came from the second upper leaves of paddy in tillering stage and the study area was located in Jianghan plain of China) by utilizing the Plant Nutrient (Tester TYS-3N). The fluorescence spectrum was also obtained by using the systembuilt based on theLIFtechnology. Fluorescence spectra of leaf with different N-content were collected and then a fluorescence spectra database wasestablished.It is analyzed that the relationship between the parameters of fluorescence (F740/F685is the ratio of fluorescence intensity of 740 nm dividing that of 685 nm) and the N level of paddy. It is found that the effect of different N-content on the fluorescence spectrum characteristics is significant. The experiment demonstrated the positive correlation between fluorescence parameters and paddy leaf N-content. Results showed a positive linear correlation between the ratio of peak fluorescence (F740/F685) and N-content. The correlation coefficient (r) reached 0.871 8 and the root mean square error (RMSE) was 0.076 82. The experiment demonstrated that LIF spectroscopy detection technology has the advantages of rapidand non-destructive measurement, and it also has the potential to measure plant content of nutrient elements. It will provide a more accurate remote sensing method to rapidly detect the crop nitrogen levels.

Paddy; N-content; Laser-induced fluorescence; Correlation analysis

Dec. 19, 2014; accepted Apr. 14, 2015)

2014-12-19，

2015-04-14

国家(973)项目(2011CB707106)和国家自然科学基金项目(41401498)资助

杨 健，1988年生，武汉大学测绘遥感信息工程国家重点实验室博士研究生 e-mail: wind_yang@whu.edu.cn *通讯联系人 e-mail： shishuo@whu.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)02-0537-04