采用HPLC法同时测定宫瘤清颗粒中大黄素、大黄酚的含量

戴希希

采用HPLC法同时测定宫瘤清颗粒中大黄素、大黄酚的含量

戴希希

目的 采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定宫瘤清颗粒中大黄素、大黄酚的含量。方法 采用色谱柱为Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm），以甲醇-水(75∶25)为流动相，流速1.0mL/min，检测波长为286nm，进样量20μL,样品用甲醇加热回流提取后，提取液蒸干，残渣加盐酸溶液(1︰10)溶解后加热回流，再用乙醚提取，提取液浓缩至干，残渣加甲醇溶解后作为供试品溶液。结果 大黄素的量在2.40～19.22μg/mL范围内（r=0.9996），大黄酚的量在5.48～43.80μg/mL范围内（r=0.9992）峰面积积分值与含量呈良好的线性关系，平均回收率分别为98.4%、98.1%。结论该方法精密度好，结果准确、可靠，灵敏度高，可用于宫瘤清颗粒中大黄素、大黄酚含量的同时测定。

宫瘤清颗粒；高效液相色谱法；大黄素；大黄酚；含量测定

江西山高制药有限公司生产的宫瘤清颗粒为全国独家品种，主要组成药材为熟大黄、桃仁、蒲黄、枳实、牡蛎、地黄、白芍、甘草等11味中药[1-4]，该药具有活血逐瘀、消癥破积、养血清热等功效，该药现行标准为国家食品药品监督管理局标准YBZ06132008。该药中熟大黄具有清湿热、泻火、凉血、祛瘀、解毒等作用。本实验对现行标准进行了提高，采用HPLC法测定该药处方中熟大黄的有效化学成分——大黄素和大黄酚的含量，建立HPLC法测定宫瘤清颗粒中所含大黄素和大黄酚含量的同时测定方法。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器 美国waters2695e HPLC仪（2489uv检测器）；电子天平（1/10万，德国赛多利斯BP-211D）。

1.2 药品与试剂 大黄素对照品（批号：110756；来源：中检院），大黄酚对照品（批号：110796-201118；来源：中检院，含量99.5%）；宫瘤清颗粒（江西山高制药有限公司，批号：20131107、20140204、20140402、20140405、20140704）；甲醇为色谱纯，AR级乙醚及盐酸。

2 实验方法与结论

2.1 高效液相色谱系统条件 色谱柱：瑞典(Akzo Nobel) Kromasil C18液相色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇︰水(75︰25)；流速为1.0mL/min；检测波长为286.0nm；进样量20μL[1]。

2.2 对照品溶液的制备方法 精密称取大黄素对照品约10mg及大黄酚对照品约20mg，置同一100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀后，用移液管精密量取10mL置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得[5-6]。

2.3 供试品溶液的制备方法 取10袋宫瘤清颗粒，精密称定内容物后，研匀，精密称定细粉（约2g),置锥形瓶中，加甲醇30mL，置水浴上加热回流30min，放冷，滤入50mL量瓶中，用甲醇20mL分次洗涤残渣及滤器，洗液并入同一量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取20mL，蒸干，残渣加盐酸溶液(1︰10)10mL溶解，置水浴上加热回流20min，立即冷却，用乙醚振摇提取4次(20mL 2次、10mL 2次)，合并提取液，浓缩至干，残渣加甲醇充分溶解，摇匀后移至10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用定量滤纸过滤，取续滤液用微孔滤膜过滤[1]。

2.4 干扰试验 采用宫瘤清颗粒处方（剔除熟大黄），依法制备阴性对照样品，采用“2.3”方法制备阴性对照溶液。结果阴性对照溶液（色谱图中10～12min处)在与供试品溶液中大黄素峰与大黄酚峰（2峰分离度大于2)相同的保留时间处无色谱峰，供试品溶液中大黄素峰及大黄酚峰保留时间均在10min之后，且与其他成分分离好，表明在此条件下，处分中其他药材的成分对该测定无干扰。色谱图见图1～图3。

图1 对照品色谱图

图2 阴性对照色谱图

图3 样品色谱图

2.5 线性关系考察 精密称取大黄素对照品约25mg及大黄酚对照品约50mg，置同一100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀后，用移液管精密量取10mL置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每毫升约含大黄素25μg、大黄酚50μg的混合溶液，分别量取此溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL至10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，依照色谱条件测定，绘制工作曲线，得回归方程：

大黄素为Y=33802X+3244.8，r=0.9996；大黄酚为Y=29873X-3143.2，r=0.9992

表明大黄素在2.40～19.22μg/mL之间，大黄酚在5.48～43.80μg/mL之间，有良好的线性关系。

2.6 精密度试验 将同一对照品溶液，进样6次，测定大黄素及大黄酚的峰面积，RSD分别为0.21%、0.30%，表明该方法精密度符合药典要求。

2.7 耐用性试验 将同一供试品溶液，依次在0～12h内（常温下每隔2h进样1次）测定大黄素的峰面积及大黄酚的峰面积。结果测得平均峰面积分别为662138、920157；RSD分别为0.26%、0.29%，表明12h内供试品中大黄素及大黄酚基本稳定。

2.8 重复性试验 取同一批号供试品（批号：20140405），按“2.3”方法进行含量测定，大黄素、大黄酚的平均含量分别为0.96、1.51mg/袋，RSD为1.6%（n=6）。

2.9 回收率试验 精密称取已知大黄素、大黄酚含量的供试品（批号：20140405）约1.0g，共5份，分别精密加入10mL 0.02402mg/mL的大黄素对照品溶液及10mL 0.03285mg/ mL的大黄酚对照品溶液，按“2.1”方法操作，计算回收率。结果见表1、表2。

表1 回收率测定结果（大黄素）

表2 回收率测定结果（大黄酚）

2.10 样品含量测定 取5份不同批号的供试品，按“2.3”方法操作，结果见表3、表4。

表3 大黄素测定结果

表4 大黄酚测定结果

3 讨论

3.1 该药的国家药品标准YBZ06132008【含量测定】中有大黄素的含量测定方法，但未同时对大黄酚进行测定，此2种化学成分虽较为接近，但能在液相色谱同一色谱条件中有效地分开[7-8]。

试验表明，在该色谱条件下，此2种化学成分分离度较好，符号药典要求。

3.2 本试验前处理较为复杂，曾摸索了各种选择试验以期简化，但提取此2种化学成分均不够完全，故最后确定取样2g，加热回流提取，以甲醇-水(75︰25)为流动相为最佳方案。

本试验方法操作简便、准确，具有良好的专属性、重现性与稳定性，认为可用于宫瘤清颗粒质量控制。

[1] 国家药典委员编.中国药典(二部)[S].北京:化学工业出版社,2010:963.

[2] 国家食品药品监督管理局.国家药品标准YBZ06132008.

[3] 王鼎峰,胡冰.HPLC法测定宫瘤清片中苦杏仁苷、黄芩苷的含量[J].海峡药学,2014,26(5):40-43.

[4] 许乾丽,茅向军,宋晓宁,等.HPLC法同时测定六味安消胶囊中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量[J].药物分析杂志,2010,30(10):1841-1844.

[5] 毕云生,范云飞,王英萍,等.HPLC法同时测定消氮颗粒中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚五种成分的含量[J].解放军药学学报,2014,30(4):324-326.

[6] 方既明,章怀奋.高效液相色谱法同时测定麻仁丸中大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚、芦荟大黄素的含量[J].中南药学, 2011,9(5):342-345.

[7] 何素琴,欧阳吉德,肖琳.HPLC法测定胆石通胶囊中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的含量[J].西北药学杂志, 2011,26(3):180-182.

[8] 薛小平,鹿燕敏,王倩,等.HPLC法测定清热解毒方芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的含量[J].中国实验方剂学杂志, 2009,15(7):6-8.

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.6.101

江西 344000 抚州市食品药品检验所 （戴希希）