5-Aza-dC在肺癌细胞系中去甲基化作用机制

童波 钟进生 梁莹 吴西雅 肖祖克 周洪 郭玲玲

5-Aza-dC在肺癌细胞系中去甲基化作用机制

童波 钟进生 梁莹 吴西雅 肖祖克 周洪 郭玲玲

目的 研究5-Aza-dC对肺癌细胞系中的去甲基化的作用。方法 对正常肺细胞以及5-Aza-dC分组处理的A549、NCI-H520甲基化特异性PCR和RT-PCR定量检测。结果 未处理的A549和NCI-H520细胞中TFPI-2表现出完全甲基化特异性。而经过5-Aza-dC处理过的肺癌细胞系细胞则表现出不完全甲基化状态，并呈现出量效关系。A549和NCI-H520细胞在经5-Aza-dC处理后TFPI-2基因mRNA表达均明显高于未处理组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；并呈现出量效关系。结论 5-Aza-dC对肺癌细胞中的TFPI-2基因具有去甲基化作用，并具有量效关系。

5-Aza-dC；TFPI-2；甲基化；A549；NCI-H520

肺癌是一种死亡率较高的呼吸系统恶性肿瘤[1]。虽然对肺癌所采用的治疗方案在不断的改善，患者5年生存率却未获得提高[2]。恶性肿瘤的侵袭和转移是造成肺癌临床治疗失败和患者死亡的主要原因[3]。早期治疗生存率明显高于晚期治疗的患者[4]。基因甲基化是肿瘤分子生物学研究的热点[5]。在肿瘤发生发展中通过去甲基化处理可恢复抑癌基因的表达，从而达到防治肿瘤的目的[5-6]。

组织因子信号通路抑制因子TFPI-2，是一种31kD大小的Kunitz 型丝氨酸蛋白酶抑制剂，分泌到细胞外基质（ECM）中，被认为是一种抑癌基因。因为TFPI-2可抑制血纤维蛋白溶解酶的活性，参与基质金属蛋白酶（MMP）的激活[2]，调控ECM的降解和肿瘤细胞浸润。大部分恶性肿瘤，例如神经胶质瘤、胰腺癌、肝细胞癌TFPI-2表达下调。在细胞中稳定转染或通过融合腺病毒导入TFPI-2后，可降低了癌细胞的浸润性[3]，但目前，还没有研究观察TFPI-2恢复表达、高表达以及去甲基化对肺癌所造成的影响。

5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-dC）可能通过使甲基化后的抑癌基因再次活化[7-10]。5-Aza-dC作为治疗恶性肿瘤的去甲基化药物已被美国食品药品管理局批准[11]。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺癌细胞系A549、NCI-H520及正常肺细胞系细胞均购自上海拜力生物科技有限公司。使用购自美国FBS公司的浓度为10%的胎牛血清培养基（Thermo fisher, 美国）。DNA提取以及修饰试剂盒购自TOYOBO，从Takara公司购买Taq DNA聚合酶，dNTPs。引物由大连宝生生物工程有限公司合成。RNA提取，RT-PCR试剂盒均购自TOYOBO。

1.2 细胞培养以及分组药物处理 对照组：同期培养不加药培养96h，只换液；A549、NCI-H520细胞株分别分为药物1组：将浓度为1×10-7mol/L的5-Aza-dC加入到DMEM培养液中培养96h；药物2组：将浓度为5×10-7mol/L的5-Aza-dC加入到DMEM培养液中培养96h；药物3组：将浓度为1×10-6mol/L的5-Aza-dC加入到DMEM培养液中培养96h。

1.3 甲基化特异性PCR 引物为，F：5′-TTTCGTATAAA GCGGGTATTC-3′，R: 5′-ACGACCCGCTAATCAAAACG-3’，非甲基化：F：5′-GGATGTTTG TTTTGTATA-3′；R：5′-AAA CATCCAAAAAAACACCTAAC-3′。反应控制条件为：20min 95℃；30s 94℃；30s 52℃；45s 72℃循环40次后在72℃保温10min，以100V的电压进行40min的电泳，进行成像。

1.4 RT-PCR定量检测 TFPI-2引物：F：5’-CAGAATT CTATGGACCCCGCTCGCCCC-3’;R:5’-CAGTCGACTTAAAATTGCTTCTTCCG-3’，以β-action作为内参。以100V的电压进行40min的电泳，在成像系统中进行成像并摄像，对比表达强度。

1.6 Western blot分析各细胞中TFPI-2蛋白表达 对各组中TFPI-2蛋白表达水平进行测定。

1.7 统计学方法 本次研究采用SPSS19.0统计学软件包进行纳入与分析，所计量资料采用“x±s”表示，采用ANOVA并t检验进行统计学分析。

2 结果

2.1 肺癌细胞系细胞TFPI-2基因甲基化影响 未处理的A549和NCI-H520细胞中TFPI-2表现出完全甲基化特异性。而经过5-Aza-dC处理过的肺癌细胞系细胞则表现出不完全甲基化状态，并呈现出量效关系。见图1。

2.2 肺癌细胞系细胞TFPI-2基因mRNA表达对比 A549和NCI-H520细胞在经5-Aza-dC处理后TFPI-2基因mRNA表达均明显高于未处理组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；并呈现出量效关系。见表1。

图1 5-Aza-dC不同浓度对肺癌系细胞处理对TFPI-2甲基化水平的作用

表1 肺癌细胞系细胞TFPI-2基因mRNA表达对比（x±s，倍）

3 讨论

肿瘤的发生发展涉及多种机制，包括细胞增殖和凋亡，细胞迁移和浸润。在这个过程中包含了ECM被一系列的诸如MMP 蛋白酶的降解。在胰腺癌、食管癌、鼻咽癌、前列腺癌中发现TFPI-2的表达能够抑制肿瘤细胞的增殖。一些研究对其机制进行了研究[9]，发现TFPI-2可降低了细胞的增殖能力，将细胞阻断在G1/S期，这同细胞周期依赖的激酶抑制因子p15和p27有关。p27（通过调控CDK2将细胞阻断在G1/S期）在细胞周期中的调控作用，例如在胰腺癌和纤维肉瘤中，都已经有报道[10]。有研究通过腺病毒，将p27转入NSCLC细胞中，使细胞停滞在G1/S期，并抑制了裸鼠移植瘤的增长。说明p27的低表达同病人预后差有关，在NSCLC中，p27表达高，病人生存期长。这也是TFPI-2肿瘤制效应的机制之一[11]。肿瘤细胞的浸润和进展也需要ECM降解，主要是通过蛋白酶，特别是MMP。研究报道[12]，TFPI-2是一种MMP活性的抑制因子，主要通过抑制纤溶酶来抑制MMP-1、-2、-3、-9。另外，除直接抑制外，TFPI-2也抑制MMP-1和-3的表达，来抑制肿瘤的增殖。SCLC手术切除标本稀少，主要是支气管镜和纵隔镜检查标本，因此仅仅够用于免疫组织化学分析。

TFPI-2是一种潜在的血纤维蛋白溶解酶抑制因子，可以通过激活MMPs参与肿瘤进展的蛋白酶，因此，TFPI-2是一种潜在的肿瘤浸润和转移的抑制因子。在诸如神经胶质瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、非小细胞肺癌的恶性肿瘤中低表达。TFPI-2作为一种抑癌基因，基因启动子区甲基化发生率明显高于正常肺组织，且能抑制TFPI-2基因的表达，可促进肺癌的发生发展。我们前期研究亦表明TFPI-2基因在非小细胞肺癌中呈低表达，基因甲基化与该基因表达沉默以及下降存在密不可分的相关性，并且其与TNM和淋巴结转移之间呈负相关性。因此TFPI-2的表达与肺癌的侵袭转移密切相关，其基因启动子区CpG岛高甲基化是TFPI-2低表达的可能机制之一，对于肿瘤的侵袭转移具有促进作用。那么，通过去甲基化治疗可促进肺癌TFPI-2基因表达，可能是肺癌治疗的新方向，可作为肺癌基因治疗的新靶点。

通过基因检测后发现TFPI-2基因在染色体7q22上，此种蛋白是一种较丝氨酸蛋白酶跟家具有抑制纤溶酶作用，并可以对多种蛋白酶起到抑制性作用。肿瘤的转移以及侵袭主要是通过使细胞外基质（ECM）降低来实现，而对ECMT的降解FPI-2具有抑制性的作用，由于此种机制使得肿瘤的生长得到控制，并对肿瘤细胞的浸润以及转移起到抑制性的作用[12]。

本次研究发现5-Aza-dC对肺癌细胞系细胞的甲基化具有一定的抑制性作用，同时还发现5-Aza-dC存在剂量依赖性。

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Objective To study the effect of 5-Aza-dC on the methylation of lung cancer cell lines. Methods Quantitative detection of A549, NCI-H520 methylation specific PCR and RT-PCR in normal lung cells and 5-Aza-dC group. Results TFPI-2 in untreated A549 and NCI-H520 cells showed complete methylation specificity. The 5-Aza-dC treated lung cancer cell lines showed incomplete methylation status, and showed a dose effect relationship. After 5-Aza-dC treatment, A549 and NCI-H520 cells were significantly higher than the untreated group, the difference was statistically significant (P＜0.05), and showed a dose effect relationship. Conclusion 5-Aza-dC has a role in the methylation of TFPI-2 gene in lung cancer cells, and has dose effect relationship.

5-Aza-dC；TFPI-2；Methylation；A549；NCI-H520

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.29.006

江西 330006 江西省人民医院呼吸内科 （童波 梁莹 吴西雅肖祖克 周洪 郭玲玲） 333200 婺源县人民医院内二科 （钟进生）

梁莹 E-mail：anlixia002@163.com