阻断Rho/ROCK信号传导通路对大鼠脊髓损伤的治疗效果

孙卫

阻断Rho/ROCK信号传导通路对大鼠脊髓损伤的治疗效果

孙卫

目的 探究阻断Rho/ROCK信号传导通路对大鼠脊髓损伤的治疗效果。方法 选取大鼠脊髓损伤动物模型150只，分为假手术组、实验组和对照组，各50只。假手术组进行椎板切除术；对照组进行脊髓横断损伤，并对其腹腔注射生理盐水；实验组进行脊髓横断手术，给予腹腔注射Fasudil。结果 实验组的RhoA mRNA明显降低。同时还能见到部分纤维以及大量的NF阳性纤维穿过脊髓横断部位，并沿其尾端伸长。结论 阻断Rho/ROCK信号传导通路对轴突再生、传导功能恢复以及损伤脊髓运动具有显著的促进作用。

Rho/ROCK信号；脊髓损伤；大鼠

成年哺乳动物的中枢神经系统一旦受到损伤，其轴突不能再生，功能不能恢复[1]。但是周围的损伤神经可以再生而且功能也能够恢复。Rho/ROCK信号在轴突再生的信号传递中起着重要的中介作用，因此可通过对信号传导通路中的Rho/ROCK信号进行抑制，进而抑制细胞外生长因子[2-3]。本研究通过阻断Rho/ROCK信号传导通路对大鼠脊髓损伤的治疗效果进行研究，确定其能否对轴突再生以及功能恢复起到促进作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取大鼠脊髓损伤动物模型150只，随机分为假手术组、实验组和对照组。体质量170～210g，采用3%的戊巴比妥钠（30mg/kg）进行腹腔麻醉，将背部正中处切开，使脊髓T6～T7通过下行椎板切除术暴漏在手术显微镜下，再将脊髓完全横断，最后将肌肉以及皮肤逐层缝合。

1.2 方法 对假手术组大鼠进行椎板切除术；实验组对大鼠进行脊髓横断手术，给予腹腔注射Fasudil（10mg/kg; ROCK抑制剂；成都苑东药业有限公司；批准文号H20040117；规格2mL：30mg/瓶）；对照组对大鼠进行脊髓横断损伤，并对其腹腔注射生理盐水。

1.2.1 提取总RNA 在术后4周，分别选取距脊髓横断上处、下处的脊髓组织10mm，与少量的液氮进行混合研磨，直至组织变软，反复加入少量液氮研磨3次。在室温条件下，以每50～100mg组织加入1mL Trizol[上海联硕生物科技有限公司；货号：15596-026（100mL）15596018（200mL）]对其进行配置，放置5min。并采用转速为12000rpm，离心处理5min。将每毫升的Trizol加入200μL氯仿进行调配，随后振荡摇匀，在室温条件下搁置15min。在温度为4℃的条件下，使用转速12000rpm，离心处理15min。将上层的水相吸出，放入另一离心管。将每毫升的Trizol加入异丙醇0.5mL，混合摇匀，在室温下，搁置5～10min。在温度为4℃的条件下，使用转速12000rpm，离心处理10min，将上清吸出，管底则为RNA。将每毫升的Trizol加入75%的乙醇1mL，震荡离心管，使其沉淀悬浮。在温度为4℃的条件下，使用转速8000rpm，进行离心处理5min，将上清吸出，室温条件下，实行晾干或者干燥处理5～10min。在55～60℃条件下，使用焦炭酸二乙酯（上海翊圣生物科技有限公司；产品货号：10602ES25；规格：25mL）50μL进行处理，并采用高压纯水RNA溶解，将样品搁置5～10min。

1.2.2 逆转录PCR 选取1μL0.2mL的总RNA置于离心管，并放入冰浴，加入1μL的RT/Taq MIX、2倍25μL反应缓冲液和各1μL的特异上下游引物[2]。通过加入DEPC—ddH2O直至体积变为50μL，采用轻柔振荡将其混匀。让其在40℃的条件下反应30min，在94℃下进行2min保温处理，将其温度及时间由94℃15s变为60℃30s，反复40次，放置在72℃下10min。提取5μLPCR产物和琼脂糖凝胶电泳2%，进行凝胶成像处理，根据RhoA和β-actin的灰度比值，确定RhoA mRNA的相对水平。

1.2.3 HE染色和NF免疫荧光染色 手术4周后，对剩余实验大鼠的心脏采用4%多聚甲醛以及4℃生理盐水进行灌注固定，分别选取距脊髓横断上处、下处的脊髓组织10mm，放入20%的蔗糖溶液，在4℃条件下，进行过夜保存。使用常规石蜡对脊髓组织进行包埋，将矢状位和横断位组织进行连续切片，将厚度保证在10μm，对切片进行染色[3]。

将石蜡切片进行水化和脱蜡处理，并加入3%的H2O2甲醇溶液，在室温下孵育10min。每次使用0.01MPBS对其进行清洗5min，反复3次，加入封闭血清在室温下封闭放置20min，将封闭液吸出，加入50倍稀释的相应一抗，在4℃下孵育过夜，使用PBS反复清洗3次，每次5min，加入相应二抗，室温下孵育30min，最后再使用PBS反复清洗3次，每次5min，用荧光显微镜进行观察。

1.3 统计学方法 用SPSS19.0统计软件对数据进行分析，计量资料采用“”表示，组间比较采用t检验；计数资料用例数（n）表示，计数资料组间率（%）的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RhoA mRNA的表达对比 将β-actin作为内参对照，通过β-actin和RhoA mRNA的灰度比值，反应RhoA mRNA的相对水平。各组时间点与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组Rho mRNA表达数据对比（x±s）

2.2 HE染色比较 假手术组为正常组织，对照组脊髓组织出现水肿，而且结构紊乱，残留的神经元相对较少，有显著的细胞浸润现象，伴随大量胶质细胞滋生。实验组相对于对照组较轻，残留的神经元相对较多。

2.3 NF免疫荧光染色比较 假手术组的脊髓组织轴突分布正常。对照组的NF排列杂乱，密度较低，而且在空洞区未发现NF阳性纤维进入。实验组NF排列杂乱，密度较高，在空洞区有部分纤维穿过横断脊髓，并沿其尾端伸长。

3 讨论

成年哺乳动物脊髓损伤，其轴突很难再生。主要原因是由于在局部环境存在一直轴突再生的抑制因子[4-5]。抑制因子可通过信号传导通路，对轴突再生进行有效抑制。小分子GTP酶Rho能够与很多分子相互作用，成为信号蛋白，具有调整神经元形成的作用[6]。当Rho酶与GTP结合后，成为Rho激酶的直接活化因子，能够和ROCK结合。激活后的ROCK可将肌球蛋白等多种靶蛋白轻链磷酸化，进而可以使神经元细胞骨架重新排列[7-8]。因此，Rho激酶是信号传导通路的重要成分。Fasudil是Rho激酶的抑制剂，作用机制是通过和ATP竞争Rho激酶催化区的结合位点，进而有效的抑制了Rho激酶的活性，阻断了信号的传递[9]。

本研究通过阻断Rho/ROCK信号传导通路对大鼠脊髓损伤的治疗效果进行研究,研究结果表明，实验组的RhoA mRNA明显降低。同时还能见到部分纤维以及大量的NF阳性纤维穿过脊髓横断部位，并沿其尾端伸长。

综上所述，阻断Rho/ROCK信号传导通路对轴突再生、传导功能恢复以及损伤脊髓运动具有显著的促进作用。

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[9] 郝珍,冷玉芳,金建萍,等.青藤碱对神经病理性痛大鼠脊髓背角神经元凋亡的影响[J].中华麻醉学杂志,2014,34(2):178-182.

Objective To explore the therapeutic effect of blocking Rho/ROCK signal transduction pathway on spinal cord injury in rats. Methods 150 rats were divided into sham operation group, experimental group and control group, 50 rats in each group. The sham operation group was the control group laminectomy; spinal cord injury, and the intraperitoneal injection of normal saline; the experimental group was given intraperitoneal injection of spinal cord transection surgery, Fasudil. Results mRNA RhoA in the experimental group was significantly decreased. At the same time also can see the part of the fiber and a large number of NF positive fibers through the spinal cord transection site, and along its tail elongation. Conclusion Blocking the Rho/ ROCK signal transduction pathway has a significant role in promoting axonal regeneration, functional recovery and spinal cord injury.

Rho/ROCK signal; Spinal cord injury; Rat

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.29.001

江西 330006 江西省人民医院神经外科 （孙卫）