膜联蛋白A1和CA19-9在胆管癌中的表达及其临床意义

李辽，王金，尚培中

（1.河北北方学院，河北张家口075000；2.解放军第二五一医院普通外科，河北张家口075000）



膜联蛋白A1和CA19-9在胆管癌中的表达及其临床意义

李辽1，王金2，尚培中2

（1.河北北方学院，河北张家口075000；2.解放军第二五一医院普通外科，河北张家口075000）

摘要：目的观察膜联蛋白A1（Annexin A1）和肿瘤特异性大分子糖蛋白抗原CA19-9在胆管癌中的表达，探讨两者与胆管癌临床病理特征之间的关系。方法采用免疫组织化学检测54例胆管癌术后标本（癌组织和癌旁组织）及15例非肿瘤胆管组织中Annexin A1和CA19-9的表达，分析两者与临床病理特征的关系。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）分别检测24例健康志愿者、24例胆管结石患者、24例胆管癌患者血清中Annexin A1和CA19-9的表达情况。结果胆管癌组织中Annexin A1和CA19-9表达的阳性率显著高于癌旁组织和非肿瘤胆管组织（P＜0.05）。Annexin A1的表达状态与胆管癌的临床病理分期、组织学分级及淋巴结转移有关（P＜0.05），而与患者发病年龄、肿瘤大小无关（P＞0.05）；CA19-9的表达与胆管癌的淋巴结转移有关（P＜0.05），而与患者发病年龄、肿瘤大小、临床病理分期及组织学分级无关（P＞0.05）。Annexin A1和CA19-9在胆管癌组织中的表达呈正相关（r=0.356，P＜0.05）。ELISA结果表明，胆管癌患者组血清中Annexin A1和CA19-9表达含量高于胆管结石患者组及健康人组（P＜0.05）。Annexin A1和CA19-9在胆管癌术前与术后血清中的表达差异有统计学意义（P＜0.05）。结论Annexin A1和CA19-9与胆管癌的发生、发展和淋巴结转移有关，联合检测可为胆管癌诊断及预后判断提供一定的参考价值。

关键词：胆管癌；Annexin A1；CA19-9

胆管癌是一种起源于肝内或肝外胆管上皮的恶性肿瘤，其发生率约占消化道肿瘤的3%，近年来全球发病率及死亡率均有所上升［1-2］。随着影像技术的发展，临床上对胆管癌的诊断取得长足进步，但是在新的肿瘤标志物研究方面仍是进展缓慢。从分子生物学角度寻求更好、更精确的指标是目前研究的热点。Annexin A1是膜联蛋白家族中的一员，具有钙依赖性磷脂结合功能，参与炎症反应、细胞周期调控、增殖、分化和凋亡等多种生物学行为［3］。近来研究表明，Annexin A1与多种肿瘤的发生、发展、转移及预后相关。CA19-9是一种含黏液成分的肿瘤特异性大分子糖蛋白抗原（carbohydrate antigen，CA），在胆胰恶性肿瘤的诊断中具有较高的敏感性和特异性，对于肿瘤的转归、复发和预后是一个有价值的指标［4］。本研究采用免疫组织化学和酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）联合检测Annexin A1和CA19-9在胆管癌中的表达，探讨Annexin A1和CA19-9与胆管的关系。

1　资料与方法

1.1组织标本

选取2010年2月-2014年1月解放军第二五一医院54例胆管癌手术切除后的蜡块标本为胆管癌组织。其中，男性34例，女性20例，男女比例1.7∶1，年龄43～82岁，平均年龄（60.370±1.249）岁。临床及病理资料齐全，术前均未接受放疗、化疗及其他针对肿瘤的治疗，术后病理组织学诊断均为腺癌。按世界卫生组织分类标准进行组织学分级［5］：高分化22例、中分化24例、低分化8例。临床分期参照美国癌症联合委员会TNM分期2010版［6］进行，其中Ⅰ期9例、Ⅱ期16例、Ⅲ期12例、Ⅳ期17例。选取距离肿瘤边缘≥1 cm经病理证实为不典型增生组织为癌旁组织。同时取15例为非肿瘤胆管组织。胆管损伤、胆管囊肿患者的胆管组织标本。

1.2血清标本

收集2014年8月-2015年4月间在解放军第二五一医院就诊的胆管癌患者24例为胆管癌组，选取同期在该院就诊胆管结石患者24例为胆管结石组，另外收集24例在该院体检中心经化验各项指标均正常体检者血清为健康组。所有患者在血清标本采集前均未行放疗及化疗，所有病例资料完整。

1.3试剂

鼠抗人Annexin A1免疫组织化学单克隆抗体（浓缩型），Annexin A1酶联免疫分析试剂盒，鼠抗人CA19-9免疫组织化学单克隆抗体（即用型），CA19-9酶联免疫分析试剂盒均系美国Cloud-Clone Corp公司；EliVisionTMplus二步法免疫组织化学染色试剂盒，二氨基联苯胺（DAB）显色液均系福州迈新生物技术开发有限公司。

1.4实验方法

1.4.1免疫组织化学EliVisionTMplus二步法所有组织标本均经10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，免疫组织化学染色步骤按试剂盒说明书进行操作，以磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照组，以公司提供的阳性切片作阳性对照组。

1.4.2酶联免疫吸附试验（ELISA）抽取患者初诊治疗前1天晨起空腹静脉血5 ml，3 500 r/min离心15 min，提取上层血清，置于-20℃冰箱冷冻保存备用，再于患者手术后第10天抽取晨起空腹静脉血5 ml，按上述方法保存。标本成批检测，血清无溶血、脂浊。所有操作严格按试剂盒说明书进行操作。

1.5结果判定

免疫组织化学染色结果通过双盲法评价，确定染色结果。Annexin A1以细胞浆或细胞膜或两者同时出现棕黄色沉着为阳性信号；CA19-9以细胞浆或细胞膜上出现棕黄色沉着为阳性表达，根据阳性细胞显色强度和百分数进行分析，依据阳性细胞显色程度计分：无显色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。依据显色细胞阳性百分比计分：高倍视野下每张切片随机选取5个视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，计算阳性细胞数占肿瘤细胞总计数百分比，无或阳性细胞＜10%记为0分，10%～25%记为1分，25%～50%记为2分，＞75%记为3分。将两个分值相加，0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～5分为阳性（++），5分以上为强阳性（+++）。

ELISA试验使用北京普朗公司生产的DNM-9602标准规格酶标仪检测，以标准物浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，选择拟合系数（即“r”值）最好的曲线方程对测得数据进行分析。

1.6统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，ELISA试验中多组计量资料用方差分析，术前与术后比较用配对t检验，免疫组织化学中Annexin A1和CA19-9的表达及其与胆管癌临床病理特征分析用X2检验，Spearman相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1Annexin A1和CA19-9在胆管癌不同组织中的表达

在胆管癌、胆管癌旁和非肿瘤胆管3种不同组织中，Annexin A1的阳性表达率分别为70.37%（38/ 54），33.33%（18/54），6.67%（1/15），各组间比较差异有统计学意义（X2=25.709，P＜0.05）；CA19-9的阳性表达率分别为74.07%（40/54），38.89%（21/54），13.33%（2/15），各组间比较差异有统计学意义（X2= 23.192，P＜0.05）。见图1、2和表1。

图1　Annexin A1在胆管组织中的表达（EliVisionTMplus×100）

图2　CA19-9在胆管组织中的表达（EliVisionTMplus×100）

2.2Annexin A1和CA19-9的表达水平与胆管癌患者临床病理特征关系

54例胆管癌患者中，Annexin A1的表达与肿瘤的分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关（P＜0.05），而与患者年龄、肿瘤大小无关（P＞0.05）；CA19-9的表达则与淋巴结转移有关（P＜0.05），而与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤的分化程度、TNM分期无关（P＞0.05）。见表2。

2.3胆管癌中Annexin A1和CA19-9表达之间的关系

38例Annexin A1阳性表达的胆管癌组织中，同时有CA19-9阳性表达32例，共阳率为59.26%，在16例Annexin A1阴性表达的标本中，同时有CA19-9阴性表达8例，共阴率为14.81%。经Spearman相关分析，Annexin A1和CA19-9在胆管癌中的表达呈正相关，两者相关系数差异有统计学意义（r=0.356，P=0.008＜0.05）。见表3。

2.43组血清标本中AnnexinA1和CA19-9的含量

胆管癌组血清Annexin A1、CA19-9表达水平明显高于胆管结石组及健康组，差异有统计学意义（Annexin A1：F =68.525，P =0.000；CA19-9：F =135.333，P=0.000）；在胆管结石组血清中Annexin A1的表达水平略高于健康组，两者差异无统计学意义（P=0.660）；CA19-9在胆管结石患者血清中的表达水平高于健康组，但两者差异也无统计学意义（P=0.731）。见表4。

2.5胆管癌组手术前后血清中Annexin A1和CA19-9的含量

胆管癌组患者手术前血清中Annexin A1和CA19-9的含量均高于手术后，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表1　Annexin A1和CA19-9在不同胆管组织中的表达　例（%）

表2　胆管癌组织中Annexin A1、CA19-9表达与临床病理特征的关系　例（%）

表3　Annexin A1和CA19-9在胆管癌中表达的关系　例

表4　3组血清中Annexin A1、CA19-9的含量（n=24，±s）

表4　3组血清中Annexin A1、CA19-9的含量（n=24，±s）

组别　Annexin A1/（ng/ml）　CA19-9/（u/ml）胆管癌组　6.314±2.957　21.558±8.250胆管结石组　1.328±0.444　2.088±0.711健康组　1.105±0.416　1.610±0.584

表5　胆管癌患者手术前后Annexin A1、CA19-9的含量（n=24，±s）

表5　胆管癌患者手术前后Annexin A1、CA19-9的含量（n=24，±s）

组别　Annexin A1/（ng/ml）　CA19-9/（u/ml）术前　6.314±2.957　21.558±8.250术后t值P值5.389±2.025 3.199 0.004 12.131±0.886 9.543 0.000

3　讨论

胆管癌的发生、发展建立在机体本身遗传因素与环境因素相互作用的基础上，是一个多阶段、多基因协同参与的过程。Annexin A1是一类钙依赖性磷脂结合蛋白，其N-末端含有多个潜在的磷酸化位点，具有调控Annexin A1与其他蛋白相互作用的功能，能够与表皮生长因子受体结合，通过MAPK/ ERK信号通路影响蛋白质复合物形成和活性，抑制细胞周期D1期表达，减少细胞增殖［7-9］。Annexin A1的异常表达可造成细胞生长紊乱，从而影响肿瘤的发生，而其在多种恶性肿瘤组织中也存在不同的表达［10-11］。Annexin A1在胃食管交界处腺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌中表达增强，在鼻咽癌、头颈部鳞癌、食管鳞状细胞癌、前列腺癌中表达降低，该表达水平迥异未发现明显规律，依目前的研究统计发现，其在鳞状细胞癌中多表达降低，而在腺癌组织中表达多呈升高趋势。本研究中采用免疫组织化学法检测Annexin A1主要表达于胆管癌细胞的胞浆和胞膜中，并且在癌组织中阳性表达率明显高于癌旁不典型增生组织和非肿瘤胆管组织。在Annexin A1与胆管癌的临床病理特征之间的关系中，笔者发现，临床TNM分期越晚的病理Annexin A1阳性率越高；病理分化越低的组织中，Annexin A1表达越高；在伴有淋巴结转移组中，Annexin A1表达高于不伴有淋巴结转移组。提示Annexin A1在正常胆管组织中有一定的生理作用，而且参与正常胆管上皮到恶性肿瘤的演变过程。

CA19-9是一种糖链抗原，由单克隆抗体116NS 19-9识别，在血清中表达为黏蛋白糖脂，在组织中表达为单涎酸神经节糖苷脂［12］。可分布在正常人的胰腺、胆管上皮等处，是目前临床上用于诊断胆管癌、胰腺癌最重要的指标，敏感性高［13］。在本研究中发现，胆管癌组织中CA19-9的表达水平由非肿瘤胆管组织、癌旁组织到胆管癌组织呈增强趋势，无淋巴结转移的胆管癌组织中CA19-9表达低于伴有淋巴结转移组，提示CA19-9与胆管癌的发生和淋巴结转移有关。

此外，笔者在对3组不同血清检测发现，胆管癌组中Annexin A1、CA19-9的表达均明显高于胆管结石组和健康组，再次验证两者在胆管癌的发生和发展中起着一定作用。杨尽晖等报道中［14］，CA19-9作为胆管癌诊断的一个重要指标，血清中的敏感性为79%，特异性为89%，且在行手术切除后，患者血清中CA19-9明显下降。而目前关于Annexin A1在血清含量及其降解的研究较少。本实验中发现，Annexin A1在胆管癌组术前中的表达高于术后。由此笔者推测两者可作为胆管癌、手术诊断、手术效果判定及肿瘤转移复发的辅助指标。

综上所述，笔者通过免疫组织化学和酶联免疫吸附试验发现，Annexin A1在胆管癌中的高表达提示其可能成为肿瘤治疗的一个新的干预靶点，调控其表达或其介导的信号转导通路［15］，并由此发现治疗胆管癌的新药物。联合检测Annexin A1和CA19-9的表达，可为胆管癌诊断及预后评估提供参考依据。

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（张蕾编辑）

论著

Expressions of Annexin A1 and CA19-9 in cholangiocarcinoma and their clinicopathological significance

Liao Li1，Jin Wang2，Pei-zhong Shang2
（1. Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei 075000，China；2. Department of General Surgery，the 251st Hospital of PLA，Zhangjiakou，Hebei 075000，China）

Abstract：Objective To investigate the expressions of Annexin A1 and CA19-9 in cholangiocarcinoma and their correlations with clinical and pathological features. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expressions of Annexin A1 and CA19-9 in 54 samples of cholangiocarcinoma and the surrounding tissues and 15 samples of non-carcinoma bile duct tissue. Statistical analysis was performed with reference to the related clinical and pathological features. Enzyme -linked immunosorbent assay（ELISA）was used to detect the expressions of Annexin A1 and CA19-9 in the serum of 24 healthy volunteers，24 patients with bile duct stones and 24 cases of bile duct carcinoma. Results The positive expression rates of Annexin A1 and CA19-9 in the cholangiocarcinoma were significantly higher than those in the peri-carcinoma tissue and non-carcinoma bile duct tissue（P＜0.05）. The positive expression of Annexin A1 was correlated with the pathological grades，clinical stages and lymph node metastasis of cholangiocarcinoma（P＜0.05）. The positive expression of CA19-9 was correlated with the lymph node metastasis of cholangiocarcinoma（P＜0.05）. The expression of Annexin A1 in the cholangiocarcinoma was positivelybook=32,ebook=37correlated with that of CA19-9（r = 0.356，P＜0.05）. The results of ELISA indicated that the expressions of Annexin A1 and CA19-9 in serum of the cholangiocarcinoma patients were significantly higher than those in the patients with bile duct stones and the healthy volunteers（P＜0.05）. In the cholangiocarcinoma patients，the expressions of Annexin A1 and CA19-9 before operation had significant differences from those after operation（P＜0.05）. Conclusions The positive expressions of Annexin A1 and CA19-9 may be correlated with carcinogenesis，development and lymph node metastasis of cholangiocarcinoma. The combined detection of the above markers possibly has certain referential value in diagnosis of cholangiocarcinoma and its prognosis.

Keywords：cholangiocarcinoma；Annexin A1；CA19-9

中图分类号：R735.8

文献标识码：A

DOI：10.3969/j.issn.1005-8982.2016.10.007

文章编号：1005-8982（2016）10-0031-05

收稿日期：2015-12-02

［通信作者］尚培中，E-mail：spz251@163.com；Tel：18903138087