桂枝提取物对动脉粥样硬化大鼠白细胞介素6/信号转导子和转录活化子3信号通路的影响

朱芹英，张卉，杨铁骊

（1.青海省西宁市第一人民医院药剂科，青海西宁810000；2.河南省黄淮学院，河南驻马店463000）



桂枝提取物对动脉粥样硬化大鼠白细胞介素6/信号转导子和转录活化子3信号通路的影响

朱芹英1，张卉2，杨铁骊2

（1.青海省西宁市第一人民医院药剂科，青海西宁810000；2.河南省黄淮学院，河南驻马店463000）

摘要：目的分析桂枝提取物对动脉粥样硬化（AS）大鼠白细胞介素6/信号转导子和转录活化子3（IL-6/ STAT3）信号通路的影响。方法选取健康纯种SD雄性大白鼠共366只，随机分为正常对照组、空白AS模型组和桂枝提取物组。免疫组织化学法检测Toll样受体4（TLR4）、肝脏X受体（LXR）、C-Jun的N末端激酶（JNK/P-JNK）、细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2/P-ERK1/2）、P38丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK/p-P38MAPK）、白细胞介素6（IL-6）、蛋白质酪氨酸激酶JAK-1抗原（JAK1/p-JAK1）、转录活化子3（STAT3/p-STAT3）及核转录因子kappa B（NF-κB）P65的表达在AS大鼠腹主动脉中的表达；用实时荧光定量PCR技术检测AS大鼠腹主动脉血管AGTRl mRNA和IL-6 mRNA的表达。结果与正常对照组比较，空白模型组腹主动脉血管IL-6阳性表达率明显升高（P＜0.05）；与空白模型组比较，桂枝提取物组IL-6的阳性表达率显著降低（P ＜0.05）。与正常对照组比较，空白模型大鼠腹主动脉血管IL-6 mRNA的表达显著升高（P＜0.05）；与空白模型组比较，桂枝提取物组IL-6 mRNA的表达显著降低（P＜0.05）。与正常对照组比较，空白模型组腹主动脉p-JAK1阳性表达率显著提高，p-STAT3阳性表达率显著降低（P＜0.05）；与空白模型组比较，桂枝提取物组p-JAK1阳性表达率显著降低，p-STAT3阳性表达率显著升高（P＜0.05）。结论桂枝提取物可以通过降低TLR4水平，升高LXR水平，同时抑制JNK、p38MAPK和ERK1/2的磷酸化，作用于NF-κB转录因子，抑制IL-6分泌，进而影响JAK2/STAT3信号转导通路。

关键词：动脉粥样硬化；桂枝提取物；信号通路转导

动脉粥样硬化（athcrosclerosis，AS）是以动脉硬化为主要病变的血管疾病，受累动脉多从内膜开始病变。发病患者一般均优先出现脂质、血栓、复合糖类集聚物、纤维组织增生及钙沉淀等症状，这些物质将在病变动脉逐步退变、钙化，累及血管弹性［1］。当疾病发展至阻塞动脉血管时，该动脉及其负责供血区域将极易出现组织器官缺血、缺氧及坏死情况，患者将出现脑中风或心肌梗塞等症状，严重影响患者生命健康［2］。桂枝提取物是中医常用药物之一，主要用于治疗风寒感冒、血塞经闭、心悸或关节痹痛等症状。为分析桂枝提取物在AS治疗中的疗效，并探究其对AS大鼠白细胞介素6/信号转导子和转录活化子3（IL-6/STAT3）信号通路的影响，笔者进行如下研究。

1　材料与方法

1.1实验材料

选取健康纯种SD雄性大白鼠共366只（购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司），每只均为200～250克，随机分为正常对照组、空白AS模型组和桂枝提取物组。其中，正常对照组予以普通饲料和自来水喂养；空白AS模型组和桂枝提取物组采用高脂饲料喂养，同时在喂养第7天行大鼠主动脉内膜球囊损伤术。桂枝提取物组在建模后第3天予以桂枝提取物给药（西安天瑞生物技术有限公司，规格：10∶1），给药体积为2 ml/kg，按照19 mg/kg给药，1次/d，持续给药16周；其余两组予以生理盐水给药。16周后，麻醉动物，取0.5 cm长度腹主动脉标本。其中，桂枝提取物为：取桂枝粉末0.5 g，加乙醇10 ml，密塞，浸泡20 min，时时振摇，滤过，滤液作为供试品溶液。

1.2主要实验仪器

兔抗人多克隆TLR4抗体及兔抗人多克隆LXR抗体购自艾博抗（上海）贸易有限公司，磷酸化p-JNK兔多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，鼠抗人ERK1/2单克隆抗体及兔抗人p-ERK1/2单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，Anti-phospho-p38 MAPK磷酸化p38MAPK抗体及鼠抗人p38MAPK单克隆抗体购自上海瑞齐生物科技有限公司，酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒由上海哈灵生物科技有限公司提供，兔抗人多克隆抗体JAK1及p-STAT3和SP免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗人多克隆NFКB P65/p-NF-κB P65抗体及大鼠白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）免疫组织化学试剂盒购自上海安妍生物有限公司，PCR仪（abi7900HT）购自APPLIED BIOSYSTEMS公司、凝胶图像分析仪和分光光度仪（UV-photometer型）购自上海精宏实验仪器厂，电泳仪和恒温水浴箱（DK-S22型）购自北京六一仪器厂，低温高速离心机购自上海梅特勒托力多仪器有限公司，光学显微镜购自日本Olympus公司，切片机购自德国DELICA公司。

1.3实验方法

造模16周后给予大鼠禁食12 h，麻醉，腹腔采血，劲椎脱位处死大鼠，分离颈总动脉，取主动脉弓起始端1.0 cm动脉，多聚甲醛固定12 h，打开大鼠腹腔，分离皮肤、脂肪组织，沿主动脉背部剪开，取2.0 cm腹动脉，冲洗，-80℃冰箱保存待检。将主动脉标本选用乙醇脱水，包膜，制片，HE染色操作，显微镜下观察动脉管壁形态学变化。将腹动脉标本冲洗后，选用油红O染色，检测标本内中性三酰甘油、脂质蛋白情况。

免疫组织化学法检测Toll样受体4（Toll like receptors 4，TLR4）、肝脏X受体（liver X receptor，LXR）、C-Jun的N末端激酶（JNK/P-JNK）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2/P-ERK1/2）、P38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，P38MAPK/p-P38 MAPK）、白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）、蛋白质酪氨酸激酶JAK-1抗原（tyrosine protein kinase JAK1，JAK1/p-JAK1）、转录活化子3（activator of transcription 3，STAT3/p-STAT3）及核转录因子kappa B（NF-κB/p-NF-κB）P65的表达在AS大鼠腹主动脉中的表达；用实时荧光定量PCR技术检测AS大鼠腹主动脉血管AGTR1 mRNA和IL-6 mRNA的表达。

1.4统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计数资料采用X2检验；计量资料以均数±标准差（x± s）表示，采用t检验；P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2　结果

2.1TLR4、LXR在不同大鼠腹主动脉中的表达

TLR4、LXR在不同大鼠腹主动脉中的表达，见表1。和正常对照组比较，空白模型组腹主动脉TLR4阳性表达率显著升高（P＜0.05）；与空白模型组比较，桂枝提取物组TLR4阳性表达率显著降低（P＜0.05）。与正常对照组比较，空白模型组腹主动脉LXR阳性表达率显著降低（P＜0.05）；与空白模型组比较，桂枝提取物组LXR蛋白阳性表达率升高（P＜0.05）。

2.2JNK/P-JNK、ERK1/2/P-ERK1/2和P38MAPK/ p-P38MAPK在不同大鼠腹主动脉中的表达

JNK/P-JNK、ERK1/2/P-ERK1/2和P38MAPK/p-P38MAPK在不同大鼠腹主动脉中的表达，见表2。磷酸化前，与正常对照组比较，空白模型组腹主动脉JNK、ERK1/2和P38MAPK阳性表达率显著增高（P＜0.05）；与空白模型组比较，桂枝提取物组JNK、ERK1/2和P38MAPK阳性表达率显著下降（P＜0.05）。磷酸化后，与正常对照组比较，空白模型组腹主动脉P-JNK、P-ERK1/2和p-P38MAPK阳性表达率显著增高（P＜0.05）；与空白模型组比较，桂枝提取物组P-JNK、P-ERK1/2和p-P38MAPK阳性表达率显著降低（P＜0.05）。

表1　TLR4、LXR在不同大鼠腹主动脉中的表达　例（%）

表2　JNK/P-JNK、ERK1/2/P-ERK1/2和P38MAPK/p-P38MAPK在不同大鼠腹主动脉中的表达（±s）

表2　JNK/P-JNK、ERK1/2/P-ERK1/2和P38MAPK/p-P38MAPK在不同大鼠腹主动脉中的表达（±s）

注：与†空白模型组比较，P＜0.05

组别　JNK/P-JNK　ERK1/2/P-ERK1/2　P38MAPK/p-P38MAPK　 X2值　P值正常对照组（n=180）　　（11.53±1.98）/（22.12±2.89）†　（1.11±0.25）/（0.08±0.02）†　（0.40±0.07）/（1.03±0.11）†　2.791　 0.023空白模型组（n=92）　　（46.96±9.11）/（58.78±11.51）　（1.99±0.18）/（0.49±0.11）　（1.44±0.14）/（1.37±0.16）　3.411　 0.002桂枝提取物组（n=94）　（17.88±3.41）/（23.31±5.01）†　（1.69±0.11）/（0.23±0.02）†　（0.64±0.05）/（0.63±0.07）†　4.562.　 0.017

2.3AGTR1 mRNA在不同大鼠腹主动脉中的表达

AGTR1 mRNA在不同大鼠腹主动脉中的表达，见表3。与正常对照组比较，空白模型组腹主动脉AGTR1 mRNA表达显著升高（P＜0.05）；与空白模型组比较，桂枝提取物组AGTR1 mRNA水平显著降低，（P＜0.05），扩增倍数为0.81。

2.4NF-κB P65和p-NF-κB P65在不同大鼠腹主动脉中的表达

NF-κB P65和p-NF-κB P65在不同大鼠腹主动脉中的表达，见表4。磷酸化前，与正常对照组比较，空白模型组腹主动脉NF-κB P65阳性表达率显著增高（P＜0.05）；和空白模型组比较，桂枝提取物组腹主动脉NF-κB P65阳性表达率显著降低（P＜0.05），磷酸化后，与正常对照组比较，空白模型组腹主动脉p-NF-κB P65阳性表达率显著增高（P＜0.05）；和空白模型组比较，桂枝提取物组腹主动脉p-NF-κB P65阳性表达率显著降低（P＜0.05）。

2.5IL-6和IL-6 mRNA在不同大鼠腹主动脉中的表达

IL-6和IL-6 mRNA在不同大鼠腹主动脉中的表达，见表5。与正常对照组比较，空白模型组腹主动脉血管IL-6阳性表达率显著升高（P＜0.05）；与空白模型组比较，桂枝提取物组IL-6的阳性表达率显著降低（P＜0.05）。与正常对照组比较，空白模型大鼠腹主动脉血管IL-6 mRNA的表达显著升高（P＜0.05）；与空白模型组比较，桂枝提取物组IL-6 mRNA的表达显著降低（P＜0.05）。

2.6JAK1/p-JAK1和STAT3/p-STAT3在不同大鼠腹主动脉中的表达

JAK1/p-JAK1和STAT3/p-STAT3在不同大鼠腹主动脉中的表达，见表6。与正常对照组比较，空白模型组腹主动脉JAK1/p-JAK1阳性表达率显著提高，STAT3/p-STAT3阳性表达率显著降低（P＜0.05）；与空白模型组比较，桂枝提取物组JAK1/p-JAK1阳性表达率显著降低，STAT3/p-STAT3阳性表达率显著升高。

表3　AGTRl mRNA在不同大鼠腹主动脉中的表达（±s）

表3　AGTRl mRNA在不同大鼠腹主动脉中的表达（±s）

注：与†空白模型组比较，P＜0.05

组别　AGTRl mRNA抑制率（%）X2值　P值正常对照组（n=180）　1.27±0.34†空白模型组（n=92）　28.52±4.33桂枝提取物组（n=94）24.95±3.09†　12.52　 3.451　 0.011

表4　NF-κB P65和p-NF-κB P65在不同大鼠腹主动脉中的表达　例（%）

表5　IL-6和IL-6 mRNA在不同大鼠腹主动脉中的表达

表6　JAK1/p-JAK1和STAT3/p-STAT3在不同大鼠腹主动脉中的表达（±s）

表6　JAK1/p-JAK1和STAT3/p-STAT3在不同大鼠腹主动脉中的表达（±s）

注：与†空白模型组比较，P＜0.05

组别　JAK1/p-JAK1　 STAT3/p-STAT3 X2值　P值正常对照组（n=180）（0.48±0.07）/ （0.13±0.02）†（0.57±0.12）/ （0.19±0.05）†　2.183 0.021 （n=92）　　（0.58±0.13）/ （0.87±0.16）　　（0.21±0.08）/ （0.13±0.07）　3.976 0.001桂枝提取物组（n=94）空白模型组（0.42±0.06）/ （0.17±0.08）†（0.27±0.05）/ （0.19±0.06）†　4.459 0.003

3　讨论

AS与高血压、高血脂、吸烟、糖尿病及肥胖等有关，发病患者症状与病变动脉位置以及附近器官受累缺血程度有关［3］。主动脉动脉粥样硬化患者常无明显症状，而AS患者，如狭窄直径超过75%，患者将合并心肌梗塞、心率失常及心绞痛，甚至猝死；脑动脉粥样硬化则可能引发脑中风、脑萎缩症状；肾脏动脉粥样硬化可能引发顽固性高血压、肾功能不全等症状；下肢动脉粥样硬化可能引发跛行、坏疽症状［4］。围绕AS的发生先后提出了很多学术意见，目前普遍认为AS是一种慢性炎症性疾病，由内皮细胞开启，过量低密度脂蛋白胆固醇聚集在血管皮下，导致白细胞渗出，血管平滑肌细胞增殖形成的病理性炎症反应过程。白细胞介素6/信号转导子和转录活化子3（IL-6/STAT3）信号通路，参与体内AS形成的病理生理反应，是具有治疗靶点潜力的细胞蛋白调节因子，主要分为促炎和抗炎性两类［5-6］。

IL-6是白细胞介素的一种，该物质广泛存在于机体内，包括多种淋巴及非淋巴细胞均可分泌IL-6，如上皮细胞、血管内皮细胞、B细胞、T细胞等［7］。这些细胞在分泌IL-6时可受多种因素调节，如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factors，TNF-α）、IL-1可增强呈纤维细胞合成IL-6；IL-4、糖皮质激素可促进单核巨噬细胞合成IL-6等。具有增强免疫反应细胞增殖、分化能力，并提高其功能的效用［8-9］。STAT3及Janus激酶信号通路是多种炎症因子的激活途径，该信号途径与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路共同参与、介导了多种细胞的反应，对炎症发生、发展具有重要调节作用［10］。

中医理论中动脉粥样硬化与痹症有关，患者多因阳气不足，水气痰饮及阴邪居于阳位，血痰互瘀，梗阻经脉，不通则痛，故治疗需以化瘀活血、化痰通络及清热解毒为主［5］。桂枝提取物是中医常用血寒经闭、痰饮、心悸、关节痹痛及风寒感冒治疗药物，本品性温，味辛、甘，归心、肺和膀胱经，具有发汗解肌、助阳化气及温通经脉值疗效，故临床常用于治疗AS。

为分析桂枝提取物对动脉粥样硬化AS大鼠白细胞介素6/信号转导子和转录活化子3（IL-6/STAT3）信号通路的影响，笔者进行了本次研究。本研究发现空白模型组腹主动脉血管IL-6表达显著升高，桂枝提取物组IL-6的水平显著降低。且空白模型大鼠腹主动脉血管IL-6 mRNA的表达显著升高，桂枝提取物组IL-6 mRNA的表达显著降低，这表明IL-6是动脉粥样硬化病变的重要参与因子，而桂枝提取物质量可显著降低大鼠IL-6含量，改善大鼠症状。同时本研究还发现与空白模型组腹主动脉p-JAK1阳性表达率显著提高，p-STAT3阳性表达率显著降低，且与空白模型组比较，桂枝提取物组p-JAK1阳性表达率显著降低，p-STAT3阳性表达率显著升高，这表明桂枝提取物可通过JAK1/ STAT3信号途径抵抗动脉粥样硬化。

综上所述，桂枝提取物是一种有效的抗动脉粥样硬化药物，其可调节TLR4、LXR、JNK、p38MAPK、ERK1/2、NF-κB及IL-6等细胞因子的表达，并影响JAK2/STAT3通路。

参考文献：

［1］刘荣乐，李剑，倪唤春，等.组织因子途径抑制物2（TFPI-2）基因多态性与急性冠脉综合征的关联性［J］.复旦学报（医学版），2013，40 （06）：685-693.

［2］QUAN J X，LIU J，GAO X B. Palmitate induces interleukin-8 expression in human aortic vascular smooth muscle cells via Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB pathway（TLR4/NF-κB-8）［J］. Journal of Diabetes，2014，6（1）：33-41.

［3］严优芍，钟伟健，郭丽冰. GC-MS分析桂枝汤不同配伍对桂枝挥发油成分的影响［J］.中药材，2012，35（3）：410-415.

［4］何本鸿，张介眉，朱旭，等.葱白提取物纳米乳口腔喷雾剂对急性心肌缺血兔心电图及心肌梗死面积的影响［J］.内科急危重症杂志，2011，17（4）：232-235.

［5］张介眉，张耕，都建军，等.葱白提取物纳米乳对急性心肌缺血兔血清NO和TnT水平的影响［J］.中西医结合研究，2011，3（2）：72-75.

［6］LEE H S，HATTORI T，PARK E Y，et al. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease［J］. Investigative Ophthalmology & Visual Science，2012，53（9）：5632-5640.

［7］闫承慧，栾波，黄明方，等. CREG调控IGF2R/IGFII内吞抑制人血管平滑肌细胞增殖［J］.中国病理生理杂志，2011，27（9）：1676-1681.

［8］陆冬晓，韩敦正，陆东风.白藜芦醇对糖尿病下肢缺血大鼠微血管新生的影响［J］.广东医学，2013，34（13）：1986-1989.

［9］李冀，于海，李胜志，等.桂枝甘草汤及其提取物组分对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究［J］.中医药信息，2011，28（1）：27-29.

［10］毛敬洁，李钻芳，黄佳，等.栝楼桂枝汤醇提物对氧化应激PC12细胞内NrF2和HO-1mRNA表达的影响［J］.世界中西医结合杂志，2013，8（6）：563-566.

（王荣兵编辑）

论著

Impact Guizhi extract on IL-6/STAT3 signaling pathway in atherosclerotic rats

Qin-ying Zhu1，Hui Zhang2，Tie-li Yang2
（1. Department of Pharmacy，the First People's Hospital of Xining City，Xining，Qinghai 810000，China；2. Henan Huanghuai College，Zhumadian，Henan 463000，China）

Abstract：Objective To analyze effect of Guizhi extraction on the interleukin-6/signal transducer and activator of transcription 3（IL-6/STAT3）signaling pathway in atherosclerosis（AS）rats. Methods Totally 366 healthy purebred male SD rats were randomly divided into normal control group，blank AS model group and Guizhi extract group. Immunohistochemistry was used to detect TLR4，LXR，JNK/p-JNK，ERK1/2/P-ERK1/2，P38MAPK/p-P38MAPK，IL-6，JAK1/p-JAK1，STAT3/p-STAT3 and NFКB P65/ p-NFКB P65 expressions in rats with aortic AS. Real-time PCR was used to detect AGTRl mRNA and IL-6 mRNA expressions in abdominal aorta of AS rats. Results Compared with the normal control group，vascular IL-6 expression was significantly increased in the abdominal aorta of the blank model group（P＜0.05）；compared with the blank model group，the level of IL-6 in the Guizhi extract group was significantly reduced（P＜0.05）. Compared with the normal control group，the positive IL-6 mRNA expression rate in the abdominal aorta was significantly increased in the blank model group（P＜0.05）. Compared with the blank model group，IL-6 mRNA expression was significantly lowered in the Guizhi extract group（P＜0.05）. Compared with the normal control group，abdominal aortic p-JAK1 level significantly increased，p-STAT3 level sig-book=12,ebook=17nificantly lowered in the blank model group（P＜0.05）. Compared with the blank model group，p-JAK1 level significantly reduced and p -STAT3 level significantly increased in the Guizhi extract group（P＜0.05）. Conclusions Guizhi extract can inhibit IL-6 secretion，thereby affect JAK2/STAT3 signal transduction pathway by reducing TLR4 level，increasing LXR level while suppressing phosphorylation of JNK，p38MAPK and ERK1/2 and acting on the NFКB transcription factor.

Keywords：atherosclerosis；Guizhi extract；signal transduction pathway

中图分类号：R-332

文献标识码：A

DOI：10.3969/j.issn.1005-8982.2016.10.003

文章编号：1005-8982（2016）10-0011-05

收稿日期：2015-10-08

［通信作者］杨铁骊，E-mail：1294881139@qq.com