心肾综合征中硫酸吲哚酚对巨噬细胞吞噬氧气型低密度脂蛋白的诱导作用的研究*

国春玲，施海涛，戚拥军，何平，张志任

（齐齐哈尔医学院附属第五医院大庆龙南医院1.肾内科；2.儿科；3.呼吸科，黑龙江大庆163453；4.哈尔滨医科大学，黑龙江哈尔滨150081）



心肾综合征中硫酸吲哚酚对巨噬细胞吞噬氧气型低密度脂蛋白的诱导作用的研究*

国春玲1，施海涛1，戚拥军2，何平3，张志任4

（齐齐哈尔医学院附属第五医院大庆龙南医院1.肾内科；2.儿科；3.呼吸科，黑龙江大庆163453；4.哈尔滨医科大学，黑龙江哈尔滨150081）

摘要：目的探讨硫酸吲哚酚（IS）对RAW264.7巨噬细胞吞噬氧气型低密度脂蛋白（ox-LDL）的诱导作用及其作用机制。方法0、10、50、100、200和400μmol/L IS处理RAW264.7细胞24 h，采用CCK-8法测定RAW264.7细胞存活率，流式细胞术测定RAW264.7细胞的Dil标记氧化型低密度脂蛋白（Dil-ox-LDL）吞噬量。200μmol/L IS处理RAW264.7细胞0、12、24、36和48 h，测定RAW264.7细胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量。IS组RAW264.7细胞用200μmol/L IS处理24 h，UO126+IS组RAW264.7细胞以5μmol/L UO126预处理2 h后再200μmol/L IS处理24 h，测定非处理组、IS组和UO126+IS组RAW264.7细胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量，并采用蛋白质印迹法（Western blot）检测在IS刺激15 min时的ERK1/1蛋白表达情况。结果IS对RAW264.7细胞存活率的浓度效应和时间效应检测中，不同组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。Dil-ox-LDL吞噬量与IS浸润浓度及处理时间均呈正相关（P＜0.01）。IS组的Dil-ox-LDL吞噬量和磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显高于非处理组（P＜0.01）。UO126+IS组的Dil-ox-LDL吞噬量略低于非处理组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；磷酸化ERK1/2蛋白表达量大幅低于非处理组，差异有统计学意义（P＜0.01）。UO126+IS组同IS组比较，Dil-ox-LDL吞噬量和磷酸化ERK1/2蛋白表达量均呈现大幅降低（P＜0.01）。结论IS可在体外直接诱导RAW264.7巨噬细胞吞噬ox-LDL，该效应经由活跃MAPK信号转导通路实现，且随IS浓度升高和浸润时间延长而增强。

关键词：硫酸吲哚酚；心肾综合征；慢性肾病；动脉粥样硬化；ox-LDL；RAW264.7巨噬细胞

BONGARTZ的“心肾连接”理论明确指出心或肾功能受损均会引发交感神经系统、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）和炎症因子的一系列波动，共同推动心肾功能进一步衰损［1-2］，以此为基础不断深入探索，心肾综合征（cardiorenal syndrome，CRS）的概念逐步成熟。流行病学调查显示，肾功能损伤提升充血性心力衰竭（congenital heart failure，CHF）的患病率15倍甚至更多，引发心血管死亡事件的可能性激增20倍。同样，约1/4的CHF病人并发有肾功能损伤，进一步发展至肾透析的危险性是普通人的5倍［3-5］。心肾体系的多因素交互影响令CRS的病理进程更加复杂多变，目前对于其发病机制仍缺乏明确阐释，使得治疗手段单一且被动。因此，探索心肾之间的恶性互动机制对于CRS的防治意义非凡。慢性肾病（chronic kidney disease，CKD）患者是动脉粥样硬化的高发人群，而尿毒症毒素是CKD成病过程中不容忽视的致病因子［6］，尤其是蛋白结合类毒素，令现有的血液净化手段事倍功半［7］。硫酸吲哚酚（indoxyl sulfate，IS）即是该类物质中最重要的成员之一，近年来成为心肾医学研究人员的关注重点。已有动物实验证实，IS清除不利会使缺失载脂蛋白E基因小鼠的主动脉斑块加速形成并恶化［8］，但目前关于IS推动动脉粥样硬化发生进展的具体机制少见报道，而巨噬细胞吞噬脂滴后泡沫化正是强直性脊柱炎病发的关键节点，所以本研究着眼于IS对巨噬细胞内吞噬氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）的诱导作用并初步探讨其机制，希望为防治CRS提供新的方向指导。现报道如下。

1　材料与方法

1.1实验细胞、材料和方法

建立6个IS浓度级且每级同时进行平行样本3孔：①传代培养至对数期的RAW264.7巨噬细胞（中科院上海细胞所）经消化、稀释至浓度2×104个/ml，接入96孔板0.1 ml/孔，置二氧化碳CO2培养箱（上海喆图科学仪器有限公司）生长，贴壁后更换稀释有IS（美国Sigma公司）的新鲜培养基，并使每孔中IS浓度分别为0、10、50、100、200和400μmol/L，待IS浸润24 h后沿孔壁加入0.01 ml/孔CCK-8试剂，充分反应4 h后依照CCK-8试剂盒（上海励瑞生物科技有限公司）方法检测细胞活力（A450），重复实验3次考察不同浓度IS对RAW264.7细胞存活率的影响；②另取细胞悬液接入12孔板2×105个/孔，置适宜环境生长，其后处理步骤同①，直至IS浸润18 h后每孔再加入Dil标记氧化型低密度脂蛋白（Dil-ox-LDL）（北京协生生物科技有限责任公司），成20 g/ml，继续培养6 h后倾出培养液，经冲洗、吹打、离心再稀释成适宜浓度细胞悬液，上BD FACSCalibur流式细胞仪（北京东迅天地医疗仪器有限公司）测定荧光强度，重复实验3次考察不同浓度IS对RAW264.7细胞吞噬Dil-ox-LDL能力的影响。

建立5个时间级且每级同时进行平行样本3孔：①RAW264.7细胞经消化、稀释至浓度2×104个/ ml，接入96孔板0.1 ml/孔置适宜环境生长，贴壁后更换新鲜培养基继续培养48 h，并于对应时间点加入IS使成200μmol/L，待IS分别浸润0、12、24、36和48 h后沿孔壁加入0.01 ml/孔CCK-8试剂，充分反应4 h后依照CCK-8试剂盒方法检测细胞活力（A450），重复实验3次考察IS作用不同时间对RAW264.7细胞存活率的影响；②另取细胞悬液接入12孔板2×105个/孔置适宜环境生长，其后处理步骤同①，直至IS分别浸润0、12、24、36和48 h后每孔再加入Dil-ox-LDL，成20 g/ml，继续培养6 h后倾出培养液，经冲洗、吹打、离心再稀释成适宜浓度细胞悬液，上流式细胞仪测定荧光强度，重复实验3次考察IS作用不同时间对RAW264.7细胞吞噬Dil-ox-LDL能力的影响。

建立3组且同时进行平行样本3孔：①浓度2×104个/ml细胞悬液接入96孔板0.1 ml/孔置适宜环境生长，贴壁后UO126+IS组更换稀释有5μmol/L UO126（上海赛鑫生物技术有限公司）的新鲜培养液，非处理组和IS组更换等量新鲜培养液，2 h后IS组和UO126+IS组再添加IS使成200 μmol/L，待IS浸润24 h后沿孔壁加入0.01 ml/孔CCK-8试剂，充分反应4 h后依照CCK-8试剂盒方法检测细胞活力（A450），重复实验3次考察各组RAW264.7细胞存活率的差异；②另取细胞悬液接入12孔板2×105个/孔置适宜环境生长，其后各组处理步骤同①，直至IS浸润18 h后各组每孔再加入Dil-ox-LDL使成20 g/ml，继续培养6 h，经冲洗、吹打、离心再稀释成适宜浓度细胞悬液，上流式细胞仪测定荧光强度，重复实验3次考察各组Dil-ox-LDL吞噬量的差异；③取细胞悬液接入培养瓶1× 106个/瓶置适宜环境生长，其后处理步骤同①，待IS浸润15 min后倾出培养液，经冲洗、吹打、离心再分离蛋白，电泳、转膜及染色后，以一抗磷酸化及总ERK（p44/42）单克隆抗体和二抗辣根过氧化物酶标记的抗兔免疫球蛋白G抗体分别孵育再曝光，蛋白印迹法（Western blot）法测定胞内细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2）蛋白表达量，重复实验2次考察各组蛋白表达量的差异。

1.2统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，细胞存活率、Dil-ox-LDL吞噬量及蛋白表达量用均数±标准差（±s）表示。对于各浓度级和时间级，以及非处理组、IS组和UO126+IS组的数据，若符合方差齐性则多组间比较采用ANOVA分析，两组间比较采用SNK-q检验；若不符合方差齐性则多组间比较采用Kendall’s W检验，两组间比较采用Tamhane’s检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1IS对RAW264.7细胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量的浓度效应

表1　IS对RAW264.7细胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量的时间效应

图1　IS对RAW264.7细胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量的浓度效应

如表1和图1。分别以IS浓度0测得的细胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量为参照标准，IS浸润浓度不同的各组间细胞存活率略有升降，差异无统计学意义（P＞0.05）；但各组Dil-ox-LDL吞噬量随IS浸润浓度增大明显升高，且比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2IS对RAW264.7细胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量的时间效应

分别以IS浸润时间0 h测得的细胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量为参照标准，IS浸润时间不同的各组间细胞存活率略有升降，差异无统计学意义（P＞0.05）；但各组Dil-ox-LDL吞噬量随IS浸润时间延长明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图2。

2.3各组RAW264.7细胞存活率、Dil-ox-LDL吞噬量和ERK1/2蛋白表达量的比较

分别以非处理组测得的细胞存活率、Dil-ox-LDL吞噬量、蛋白表达量为参照标准。与非处理组数值比较，IS组和UO126+IS组的细胞存活率及总ERK1/2蛋白表达量均略低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。同时，IS组的Dil-ox-LDL吞噬量和磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显高于非处理组，且差异有统计学意义（P＜0.01）。UO126+IS组的Dil-ox-LDL吞噬量与非处理组比较略低，但差异无统计学意义（P＞0.05）；磷酸化ERK1/2蛋白表达量大幅低于非处理组，差异有统计学意义（P＜0.01）。此外，UO126+IS组与IS组比较，细胞存活率及总ERK1/2蛋白表达量虽有升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；Dil-ox-LDL吞噬量和磷酸化ERK1/2蛋白表达量均呈现大幅降低，且差异有统计学意义（P ＜0.01）。见表2和图3、4。

图2　IS对RAW264.7细胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量的时间效应

图3　各组总ERK1/2蛋白和磷酸化ERK1/2蛋白的比较

图4　各组RAW264.7细胞存活率、Dil-ox-LDL吞噬量和ERK1/2蛋白表达量的比较

表2　3组间细胞存活率、Dil-ox-LDL吞噬量和ERK1/2蛋白表达量的比较

3　讨论

人体是高度精密的“仪器”，各脏器之间既分工明确又协同合作。心肾是高效平稳的生命运作最重要的两大部分，共同承担着维持血液动力学稳定和体液平衡等多重重任［9］，生理功能的密切相关直接决定了两者在病理过程的交互影响。自1840年PIORRY、HERITIER定义尿毒症以来，已有200余种毒素被成功鉴定，它们在心肾、血管、神经和免疫系统等的衰退中扮演着重要的角色［10］。健康人体可经肾脏将摄入氨基酸转化而来的IS及时“扫地出门”，进出均衡状态下IS不会在血液中游离存在，而在CKD患者体内，清除率下降极易造成IS存积于肾单元，器质性的损伤又进一步加深肾功缺失陷入“死循环”［11-12］。此外，过剩IS游离入血引发血清浓度激增，使得心血管疾病风险飙升［13-14］，已有研究证实，血清IS不仅上调P53、P21基因表达诱使平滑肌细胞衰亡［15］，而且调控Klotho蛋白表达引导内皮细胞障碍［16］。所以，IS在CRS整个病程中推波助澜不容忽视，同时也极有可能成为预防病发、延缓病情发展的决定性突破口。

本次研究发现，IS并未对RAW264.7巨噬细胞表现直接抑制作用，但RAW264.7细胞吞噬Dil-ox-LDL总量对IS浸润浓度和时间均呈现正相关。ox-LDL是强直性脊柱炎起病的根源，全面参与病情进展的各个阶段，巨噬细胞则是人体健康的忠诚卫士，负责辨识和扫清入侵内部的“捣乱分子”。巨噬细胞将尽可能多ox-LDL吞纳入体内，自身也受其毒性影响逐渐凋亡泡沫化，包裹有大量脂质的巨噬源性泡沫细胞黏集于受损的血管壁内表面开启了强直性脊柱炎最早的病变序幕—脂质条纹［17-18］。健康人体和CKD患者的血清IS含量差异巨大，正常IS血清浓度不足10μmol/L，研究中该浓度尚未能对ox-LDL吞噬量产生明显影响；CKD患者IS血清浓度均值高达100～200μmol/L［19］，而本次结果清晰显示，50～400μmol/L IS的存在均可诱导增效RAW264.7细胞吞噬ox-LDL。而且ox-LDL吞噬量随IS浸润时间延长而急剧升高也表明，高浓度IS在体内滞留时间越长，巨噬细胞泡沫化情况越严重。

笔者发现，在IS的作用下，随ox-LDL吞噬量激增的还有RAW264.7细胞内磷酸化ERK1/2蛋白表达量，当以UO126专属性阻断ERK1/2蛋白表达的上游通路时，UO126+IS组的Dil-ox-LDL吞噬量回落至未处理组同等水平，伴随磷酸化ERK1/2蛋白表达量大幅降低。因此推断，IS对RAW264.7细胞吞噬氧化低密度脂蛋白的诱导增强作用同MAPK信号转导通路存在密切联系。如果将细胞视作城堡，表面受体即为驻守边疆的“情报接收站”，细胞核担当“中央指挥部”，MAPK信号转导通路是负责将信息由外向内传送的主要驿道，ERK1/2则是路途上最重要的信使之一［20］。ERK1/2平时游走于胞质间待命，只有被Raf磷酸化激活后才能迅速苏醒，携带信息穿透入核。IS增强RAW264.7细胞对ox-LDL的吸收可能是介由引发RAW264.7表面特异辨识氧化低密度脂蛋白的清道夫受体和CD36异常兴奋，使MAPK信号转导通路高度活跃，活化ERK1/2蛋白量提升。UO126有效截断了MAPK的级联反应，得以抑制IS对RAW264.7细胞吞噬氧化低密度脂蛋白的诱导增强作用。

综上所述，IS经由活跃MAPK信号转导通路，激动ERK1/2蛋白实现对巨噬细胞吞噬ox-LDL的诱导增效作用，且该效应随IS浓度升高和浸润时间延长而增强。所以及时有效地排除患者体内IS可在一定程度上避免和缓解动脉粥样硬化危机，有利于CRS的良好预后。

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（张蕾编辑）

论著

Induction effect of indoxyl sulfate on uptake of ox-LDL by macrophages*

Chun-ling Guo1，Hai-tao Shi1，Yong-jun Qi2，Ping He3，Zhi-ren Zhang4
（1. Department of Nephrology；2. Department of Pediatrics；3. Department of Respiratory Diseases，Daqing Longnan Hospital of the Fifth Hospital Affiliated to Qiqihar Medical School，Daqing，Heilongjiang 163453，China；4. Harbin Medical University，Harbin，Heilongjiang 150081，China）

Abstract：Objective To investigate the induction effect and mechanism of indoxyl sulfate（IS）on uptake of ox-LDL by RAW264.7 macrophages. Methods RAW264.7 cells were treated with 0，10，50，100，200 and 400 μmol/L IS for 24 h. CCK-8 assay was employed to obtain the cell survival ratio of RAW264.7 cells，and flow cytometry was employed to detect uptake of ox-LDL by RAW264.7 cells. After RAW264.7 cells were treated with 200 μmol/L IS for 0，12，24，36 and 48 h，and the cell survival ratio and uptake of ox-LDL were obtained. RAW264.7 cells of the IS group were treated with 200 μmol/L IS for 24 h，while the cells of the UO126+IS group were treated with 5 μmol/Lbook=26,ebook=31UO126 for 2 h in advance and 200 μmol/L IS for 24 h. Then the survival ratio of RAW264.7 cells and uptake of ox-LDL were determined in the non-treated group，IS group and UO126+IS group. And Western blot was used to detect the expression of ERK1/2 protein in the three groups. Results In the detection of dose-dependent effects and time-dependent effects of IS on RAW264.7 cell survival ratio，there was no significant difference between the groups （P＞0.05）. Uptake of Dil-ox-LDL positively correlated with the concentration of IS and the action time（P＜0.01）. Uptake of Dil-ox-LDL and the expression of p-ERK1/2 of the IS group were greatly higher than those of the nontreatment group（P＜0.01）. Uptake of Dil-ox-LDL of the UO126+IS group was slightly lower than that of the nontreatment group，and the difference was no statistically significant（P＞0.05）. While the expression of p-ERK1/2 of the UO126+IS group was obviously lower than that of the non-treatment group（P＜0.01）. Uptake of Dil-ox-LDL and the expression of p- ERK1/2 of the UO126+IS group were significantly lower than those of the IS group（P＜0.01）. Conclusions IS can directly induce uptake of ox-LDL by RAW264. 7 macrophages in vitro through activation of MAPK signaling pathway，and the effect is enhanced with increasing concentration and action time.

Keywords：indoxyl sulfate；cardiorenal syndrome；chronic kidney disease；atherosclerosis；ox-LDL；RAW264.7 macrophage

中图分类号：R692

文献标识码：A

DOI：10.3969/j.issn.1005-8982.2016.10.006

文章编号：1005-8982（2016）10-0025-06

收稿日期：2015-11-19

*基金项目：2012年度高等学校博士学科点专项科研基金（No：20122307110008）