低氧条件适用性硅酸盐细菌的分离及对水稻幼苗生长影响

李佳, 袁洪水, 王伟, 朱宝成

河北农业大学生命科学学院, 保定 071001

低氧条件适用性硅酸盐细菌的分离及对水稻幼苗生长影响

李佳, 袁洪水, 王伟, 朱宝成*

河北农业大学生命科学学院, 保定 071001

从湖南地区水稻田土样中分离适用于水田作物的硅酸盐细菌, 得到在亚历山大罗夫培养基上符合硅酸盐细菌菌落特征的菌株1株, 编号为菌株s-3。通过一系列的生理生化试验, 菌体形态及菌落特征的观察以及16S rDNA序列分析对菌株s-3进行菌种鉴定, 初步鉴定菌株s-3属于硅酸盐细菌的一种——环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)。通过在不同供氧条件下测定菌株s-3的解钾能力, 发现在微氧条件下菌株s-3仍能保持较高的活性。通过水培试验, 测定菌株s-3作为生物肥料对水稻植株幼苗的促生长能力, 发现施用菌株 s-3培养液后, 可大幅增加植株的钾总量, 促进植株生长, 具有作为生物肥料进一步研究的潜力。

硅酸盐细菌; 分离; 解钾活性; 解磷活性

1 前言

土壤本身作为一个天然钾库, 其每公顷土壤耕作层中含钾量约为 26100 kg, 而 90%—98%以上的钾存在于正长石和云母等矿物中, 不能直接被植物吸收利用, 这就形成了土壤既富含钾又缺钾的现象[1-2]。

硅酸盐细菌(Silicon bacteria)是指能分解硅酸盐类矿物的细菌。目前硅酸盐细菌主要有三种： 环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)和土壤芽孢杆菌(Bacillus edaphicus)[3-5]。2010年, 胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)和土壤芽孢杆菌(Bacillus edaphicus)又重归类为胶质类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)和土壤类芽孢杆菌(Paenibacillus edaphicus)。有报道表明, 硅酸盐细菌具有分解土壤中含钾矿物质, 活化钾元素供作物吸收利用, 增加作物产量的能力[6-7]。因此, 在化肥污染严重的今天, 开发硅酸盐细菌作为生物肥料来挖掘土壤中的钾元素资源, 具有十分重要意义。

然而, 开发形成硅酸盐菌剂产品作为生物肥料其功效往往因其施用的土壤环境不同而不同, 土壤环境不同, 尤其是水田和旱田溶氧量的不同会直接影响菌株在植株根系区域的定植、生长、繁殖状态以及与土壤周围环境的相互作用, 从而进一步影响菌剂型生物肥料的作用效果。但是目前市售的相关硅酸盐菌剂产品中, 并没有考虑到这一点, 也未见有针对性产品销售[8]。

本文对从湖南地区水稻田土壤中分离得到的符合硅酸盐细菌菌落特征的菌株 s-3通过形态观察、生理生化特征和16S rDNA序列分析进行了初步鉴定, 并在不同供氧条件下对其解钾能力进行了初步研究, 同时通过水培试验, 测定菌株s-3作为生物肥料为水稻提供钾养分, 促进水稻植株幼苗生长的能力, 为其作为生物肥料用于水田作物奠定一定的理论基础。

2 材料和方法

2.1 试验样品

土壤样品来源： 湖南省娄底市水稻田土壤;

对照菌株： 从商品化的生物钾肥中分离的硅酸盐细菌菌株k-7。

水稻种子： 春光 1 号, 购于四川省南充市某种子公司。

2.2 培养基

发酵培养基： MgSO4·7H2O 2.0 g, FeCl30.2 g, CaCO31.0 g, 蔗糖 2.0 g, 淀粉 7.0 g, 硫铵 0.5 g, K2HPO42.0 g, 酵母膏 0.8 g, 豆饼粉 0.7 g, pH 7.0,蒸馏水 1 000 mL。

亚历山大罗夫培养基见《微生物实验指导》[9]。

生理生化试验所用培养基见《常见细菌系统鉴定手册》[10]。

2.3 主要试剂

生理生化试验所用试剂见《常见细菌系统鉴定手册》[10]。

耗氧剂： 还原性铁粉1.0 g、低亚硫酸钠5.0 g、碳酸氢钠5.0 g、水2.2 mL。用于容积为1 L的空间。

2.4 试验方法

2.4.1 土壤样品的采集

采用常规土壤样品取样法[9], 取土样于牛皮纸袋中, 风干并记录采样信息。

2.4.2 硅酸盐菌株的分离

取1.0 g土壤样品, 采用常规的梯度稀释涂布平板法[9]获得一系列土壤样品稀释液, 取适宜梯度土壤样品稀释液各0.5 mL涂布亚历山大罗夫培养基平板, 于置有足量耗氧剂的环境中, 28 ℃培养5 d。之后对比典型硅酸盐细菌菌落特征, 挑选菌落特征吻合的菌株, 接种亚历山大罗夫培养基, 28 ℃培养5 d,同时, 将所选菌株进行划线验纯, 选择纯菌株保存于4℃冰箱。

2.4.3 菌株s-3的形态观察

刮取少量菌株 s-3的菌体细胞采用常规的梯度稀释涂布平板法[9]得到适宜浓度梯度的菌体悬液涂布亚历山大罗夫培养基平板, 于置有足量耗氧剂的环境中, 28 ℃培养5 d。获得单菌落进行观察。采用常规方法[10]取菌株 s-3的菌体细胞进行革兰氏染色并观察其菌体形态

2.4.4 基因组DNA的提取及16S rDNA的扩增纯化

试验于2014—2015年在靖远县永新乡野生甘草抚育基地进行。该地区属暖温带大陆性气候，海拔2 039 m，位于东经 104°35′35.1″、北纬 37°04′16.5″，干旱少雨，风大沙多，植被稀少，年降雨量200 mm左右，主要集中在7—9月，蒸发量在2 179.8 mm，年平均气温在8.5℃，大于10℃的积温2 944℃，年平均风速2.6 m/s，大风天数为50～90 d，绝对无霜期128 d。

将菌株s-3接种液体培养基培养至对数生长期,取适量培养液采用 CTAB法[8]提取基因组 DNA, -20 ℃保存。以琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量并进行16S rDNA序列扩增。

PCR条件为： 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s,57 ℃退火40 s, 72 ℃延伸90 s, 共32个循环; 最后72 ℃延伸10 min。产物纯化后送华大基因工程有限公司测序。

2.4.5 16S rDNA序列分析及系统发育树的构建

将测定的菌株s-3的16S rDNA基因序列输入GenBank中, 与其中原核生物各种属的标准菌株16S rDNA基因序列比对, 根据比对结果构建系统发育树并计算菌株s-3与相关建树菌株16S rDNA基因序列之间的相似性。构建系统发育树采用phylip软件包。重建系统发育树采用Treeview软件[11]。

2.4.6 菌株的生理生化测定

根据《常见细菌系统鉴定手册》中相应属、种鉴定有关的内容, 共进行了菌株厌氧性测定、V.P试验、酪素水解、硝酸盐还原、卵磷脂酶试验、吲哚试验、柠檬酸盐、甲基红、苯丙氨酸脱氨酶、淀粉水解、过氧化氢酶、葡萄糖、甘露醇等发酵试验、脲酶、明胶液化等生理生化试验, 具体方法见《常见细菌系统鉴定手册》[10]。

2.4.7 在不同溶氧发酵条件下菌株解钾活性的测定

发酵分三组： 第一组以透气膜封口, 上摇床发酵(180 r·min-1); 第二组以透气膜封口, 静止发酵; 第三组以不透气的塑料膜封口, 加耗氧剂静止发酵。

在无钾发酵培养液中加入终浓度为 1.0 g·mL-1的钾铝酸盐, 接种供试菌株 s-3, 分别在不同供氧条件下进行发酵, 每项三个平行, 培养48 h, 得到发酵液, 利用原子吸收分光光度法测定发酵液中水溶性钾含量, 在半小时内比浊完毕, 同时作空白实验。

2.4.8 菌株s-3水培试验

以春光 1号水稻为供试种子, 采用常规水培方式测定菌株 s-3作为生物钾肥对水稻幼苗生长的影响。实验组使用量0.5 mL发酵液/粒种子, 对照组：0.5 mL蒸馏水/粒种子, 实验设计3个重复, 每个重复三个平行, 每个平行20粒种子。观察记载培养30 d后处理和对照上述供试作物的株高、最大叶长、最大叶宽、假茎宽、根数、白根数、根长、鲜重和干重,并以四苯硼钠比浊法测定植株中钾养分的含量。

3 结果与分析

3.1 硅酸盐细菌的分离纯化

从水稻田土样分离得到符合硅酸盐细菌菌落形态特征的细菌菌株1株, 编号为： s-3。

3.2 菌落形态观察

供试菌株 s-3单菌落为圆形凸起、边缘完整、表面湿润光滑、无色透明的大型菌落, 像半粒玻璃珠平贴于平板上, 菌落粘稠, 富有弹性, 挑起时能拉成很长的丝。符合典型的硅酸盐细菌的单菌落特征, 单菌落形态见图1。

3.3 菌体特征观察

供试菌株 s-3经革兰氏染色在显微镜下观察呈阳性, 菌体呈杆状, 两端钝圆, 长约2.5 μm, 直径约0.7 μm, 芽孢次端生。

3.4 16S rDNA序列分析

测定菌株s-3的16S rDNA基因序列, 将该序列输入GenBank中, 与其中原核生物各种属的标准菌株 16S rDNA基因序列比对, 根据比对结果构建系统发育树(图2)并计算菌株s-3与相关建树菌株16S rDNA基因序列之间的相似性(表1)。构建系统发育树采用phylip软件包。

由试验结果可知, 供试菌株s-3的16S rDNA序列和与之参比的芽孢杆菌属相应标准菌株同源相似度大部分在98%以上, 因此可初步判断菌株s-3属于芽胞杆菌属(Bacillus)。

3.5 菌株的生理生化测定

生理生化试验结果见表2。

供试菌株s-3为化能异养细菌, 能利用蔗糖、葡萄糖、甘露醇等多种碳源; 最适生长温度为 28℃左右, 最适生长pH 6.8—7.0左右。

通过对供试菌株 s-3的菌落形态、菌体特征的观察, 16S rDNA序列分析以及生理生化特征测定,根据《常见细菌鉴定手册》[10]和相关文献中有关种、属鉴定的相关内容, 初步鉴定供试菌株s-3为环状芽孢杆菌(Bacillus circulans), 属于硅酸盐细菌的一种。

图1 菌株s-3单菌落形态Fig. 1 Single colonial morphology of strain s-3

图2 依据16S rDNA序列构建的菌株s-3及相关菌株的系统发育树Fig. 2 Neighbour-joining tree based on 16S rDNA sequences showing relationship between strain s-3 and related strains

表1 菌株s-3与参比菌株的16S rDNA序列相似性Tab. 1 Similarity of the sequences of 16S rDNA between strain s-3 and reference strains

表2 菌株s-3的生理生化特征Tab. 2 Physiological and biochemical characteristics of strain s-3

3.6 在不同溶氧发酵条件下菌株的解钾活性

以透光度为纵坐标, 钾标准使用液浓度为横坐标, 绘制成标准曲线, 得到回归方程： Y=0.1209x—0.1451; R=0.9896。

在不同溶氧发酵条件下进行发酵, 测定对照菌株 k-7及供试菌株 s-3的解钾活性, 每项三个平行,取平均值。根据待测液透光度的平均值, 即可从回归方程中算得相应的钾元素含量(结果见表3)。

将上述实验中测定的不同溶氧发酵条件下对照菌株k-7和供试菌株s-3的解钾量进行成对双样本均值分析t—检验, 结果表明： P＜0.05, 即对照菌株k-7显著低于供试菌株s-3。尤其是, 当供氧条件发生变化时, 与对照菌株k-7相比, 供试菌株s-3表现出的解钾活性受到的影响较小, 当发酵体系中溶氧下降,溶氧浓度相对较低时, 对照菌株 k-7的解钾活性下降了超过50%, 而菌株s-3的解钾活性仍能保持原水平的 95%左右。可见, 由水田土壤分离得到的硅酸盐细菌菌株 s-3在水田等溶氧浓度相对较低的环境下, 仍可能具有较高的溶解环境中不溶的钾元素的能力, 使钾元素更易被作物吸收利用, 因而具有进一步研究开发作为生物钾肥施用于水田作物的较大潜力。

3.7 菌株s-3水培试验

以春光 1号水稻为供试种子, 采用常规水培方式培养30 d, 观察记载培养30 d后处理和对照上述供试作物的株高、最大叶长、最大叶宽、假茎宽、根数、白根数、根长、鲜重、干重和钾含量(表4)。

从表4看出, 水稻配施菌株s-3发酵液后, 植株的株高、最大叶长、最大叶宽、假茎宽、根数、白根数、根长、鲜重、干重和钾含量均高于对照。相对于对照组来说, 实验组植株内钾含量平均增加了17.31%, 株高、最大叶长、最大叶宽、假茎宽、根数、白根数、根长、鲜重和干重则分别提高了 17.31%、16.56%、22.52%、17.17%、3.42%、20.08%、26.16%、7.36%、29.81%、36.66%。将以上水稻农艺性状数据进行成对双样本均值分析 t—检验可知： 实验组植株内钾含量及其他农艺性状数据均显著高于对照组(P＜0.05)。由此可见, 施用菌株s-3培养液可显著促进水稻植株生长发育, 提高植株内钾含量, 明显增加植株钾养分含量。因此, 菌株s-3应具作为生物肥料用于水田作物种植的潜力, 有进一步研究的价值。

表3 不同溶氧发酵条件下菌株s-3和k-7的解钾活性Tab. 3 Activity of releasing potassium of strain s-3 and strain k-7 on different level of oxygen dissolution

表4 水稻农艺性状比较Tab. 4 Comparison of Agronomic characters of different rice plants

4 讨论

现代农业中, 种植农作物时常常需大量钾元素来提高农作物的产量。土壤本身作为一个天然钾库,其每公顷土壤耕作层中含钾量约为 26100 kg, 但是90%—98%以上的钾存在于正长石和云母等矿物中,很稳定, 不能直接被植物吸收利用, 这就形成了土壤既富含钾又缺钾的现象[4,12-14]。硅酸盐细菌具有分解土壤中含钾矿物质, 释放钾元素的能力, 可将土壤中不能直接被植物吸收利用的钾元素转化为植物可吸收利用的可溶性钾, 增加作物产量。因此, 硅酸盐细菌作为土壤中的一类重要的功能菌, 将其开发作为生物肥料来转化利用土壤中的钾元素等资源,这对发展生态、经济农业具有十分重要意义[2,5,15-16]。

目前在生物肥料的应用中存在一些普遍的问题：硅酸盐菌剂作为一种微生物肥料, 其功能的有效发挥必须满足两个基本条件： 一是菌株的高效性, 二是菌株本身对不同作物及土壤环境的适应性[17-20]。自然环境中水田和旱田的溶氧条件不同, 通常水田中氧含量较低, 并且会明显低于旱田中氧含量。但是目前市售的相关硅酸盐菌剂产品中, 并未有针对性产品出现, 例如针对水田低氧环境的产品并未见有销售, 在相关研究报道中, 该方面的应用研究亦不多见[8]。本文以水田土壤为样品, 从中分离的硅酸盐细菌菌株 s-3, 相对于对照菌株 k-7来说, 具有较高的解钾活性, 同时, 菌株s-3对水田土壤环境, 尤其是微氧环境的适应能力亦较强, 在此环境下, 菌株s-3可保持较高解钾活性, 另外, 以春光1号水稻为供试种子, 采用常规水培方式测定了菌株 s-3作为生物钾肥对水稻幼苗生长的影响, 有实验结果可以看出施用菌株 s-3培养液后, 水稻幼苗钾总量大幅增加, 植株的株高、最大叶长、最大叶宽、假茎宽、根数、白根数、根长、鲜重和干重亦均高于对照组植株, 可见菌株 s-3确实具有作为生物钾肥促进水稻等水田作物生长的潜力。因此, 菌株s-3作为生物肥料用于水田作物种植的可行性较大, 应具有作为水田作物生物肥料进一步研究的价值。

而将菌株 s-3开发为生物肥料用于水田作物种植, 若要其发挥较好的肥效则还需进一步探索适宜的菌剂工业化生产工艺, 并研究该菌剂在不同作物的植株根系区域的定植、生长、繁殖状态以及与土壤周围环境的相互作用, 探索适宜的菌肥产品施用方法、施用时期及施用量。

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Isolation of silicate bacteria from paddy field and determination of activity of the strain

LI Jia, YUAN Hongshui, WANG Wei, ZHU Baocheng*
College of Life Science, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China

From the soil samples of paddy field in Hunan area, several silicated bacteria strains had been isolated, which could be used as a kind of biological fertilize applied to paddy-field. As a result, a strain named s-3 which was similar to the silicate bacteria was obtained. Then the strain was identified by morphological and culture features observation, a series of physiological and biochemical experiments and 16S rDNA sequence analysis. Based on the results, strain s-3 was identified as Bacillus circulans, a kind of silicate bacteria. The ability of strain s-3 to release potassium at different levels of oxygen dissolution was determined. As a result, we found that on the condition of low oxygen dissolution, strain s-3 still had a certain level of activity of releasing potassium. And then the activities of strain s-3 as a biological fertilizer to release potassium nutrient and to promote rice growth were determined through hydroponic experiment. As a result, we found that the culture fluid of strain s-3 had a certain level of activity to increase the content of K in rice and promote rice growth, which indicated its potential as a bio-fertilizer.

silicate bacteria; isolation; activity of releasing potassium and phosphorus

10.14108/j.cnki.1008-8873.2016.01.016

Q93

A

1008-8873(2016)01-103-06

2014-12-27;

2015-02-13

胶冻样类芽孢杆菌肥料制剂生产工艺及其应用

李佳(1982—), 女, 山西, 讲师, 硕士, 研究方向为农牧微生物学, E-mail： qilan82@126.com*通信作者：朱宝成, 教授, 博士研究生导师, 主要从事农牧微生物学研究

李佳, 袁洪水, 王伟, 等. 低氧条件适用性硅酸盐细菌的分离及对水稻幼苗生长影响[J]. 生态科学, 2016, 35(1)： 103-108.

LI Jia, YUAN Hongshui, WANG Wei, et al. Isolation of silicate bacteria from paddy field and determination of activity of the strain[J]. Ecological Science, 2016, 35(1)： 103-108.