表皮生长因子受体表达与突变亚型在非小细胞肺癌中的临床意义

张　竞, 王　彬, 王云喜, 王　波, 初向阳

(解放军总医院 胸外科, 北京, 100853)



表皮生长因子受体表达与突变亚型在非小细胞肺癌中的临床意义

张竞, 王彬, 王云喜, 王波, 初向阳

(解放军总医院 胸外科, 北京, 100853)

摘要:目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者表皮生长因子受体(EGFR)基因的mRNA表达水平及EGFR亚型突变情况。方法收集128例NSCLC患者的临床资料，使用液相芯片技术对患者标本的EGFR E18-21基因突变情况和EGFR的mRNA表达水平进行检测。结果本组患者EGFR基因突变率为47.7%, 其中E19基因突变率为21.1%, E21基因的突变率为26.6%，无E18及E20基因突变。EGFR E19基因突变与吸烟史呈显著相关性(r=0.238, P<0.01)，EGFR E21基因发生突变与肿瘤病理类型(r=-0.213, P<0.05)和肿瘤分化程度(r=-0.190, P<0.05)都呈现相关性。EGFR基因表达水平与肿瘤病理类型相关(r=0.244, P<0.01)。结论 EGFR突变好发于19、21外显子，其中无吸烟史患者易发生E19突变，腺癌及肿瘤分化程度高的患者易发生E21突变。腺癌患者中的EGFR基因表达水平更高。

关键词:非小细胞肺癌; 靶向治疗; 表皮生长因子受体

约80%的肺癌患者病理类型为非小细胞肺癌(NSCLC)[1]。传统治疗肺癌的方法包括手术及放化疗，但总体疗效并未显著提高。以表皮生长因子受体(EGFR)的小分子TKI(如厄洛替尼和吉非替尼)或单克隆抗体(如西妥昔单抗)为代表的EGFR基因靶向治疗成为NSCLC的一线或二线治疗方案[2-4]。本文收集128例确诊非小细胞肺癌患者的临床资料，采用Luminex液相芯片技术对肿瘤细胞的EGFR E18-21基因突变情况和EGFR基因的mRNA表达进行定量检测，现将结果报告如下。

1材料与方法

1.1临床资料

收集解放军总医院胸外科2014—2015年经病理确诊的非小细胞肺癌患者临床资料共计128例，所有患者均未接受化放疗、靶向治疗等抗癌治疗，无合并其他原发肿瘤，有完整的临床资料及本院病理科病理报告。组织学标本由手术中切取或经皮肺穿刺得到。记录患者年龄、性别、吸烟史、病理类型、分化程度、TNM分期等相关临床资料信息。本组患者中男67例，女61例；年龄小于60岁的患者85例，60岁以上的患者43例；92例无吸烟史，36例有吸烟史。病理类型为腺癌110例，鳞癌13例，腺鳞癌3例，大细胞癌1例，神经内分泌癌1例。肿瘤细胞低分化患者18例，中分化患者76例，高分化患者34例。TNM分期根据2009年美国癌症联合委员会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)联合制定的国际肺癌分期(第7版)标准进行，全组患者中共有Ⅰ期患者85例，Ⅱ期患者15例，Ⅲ期及Ⅳ期患者28例。

1.2实验方法

1.2.1实验试剂：DNA提取试剂盒购自Macherey-Nagel公司，分子克隆酶购自Invitrogen公司，链霉亲和素-藻红蛋白购自QIAGEN公司，羧基化荧光微球及液相基因芯片系统均采用Luminex公司产品。

1.2.2EGFR基因突变检测：对组织样品采用xTAG-液相芯片法进行基因突变检测，具体实验步骤如下：首先使用Macherey-Nagel公司的DNA提取试剂盒，对肿瘤标本石蜡包埋组织切片中的基因组DNA进行提取，用分光光度计对DNA浓度进行定量，要求样本浓度大于20 ng/μL，总量大于200 ng；然后进行聚合酶链式反应(PCR)预扩增，得到目标基因片段；使用核酸外切酶及碱性磷酸酶水解，消除多余的引物和核苷酸，防止其后续的探针非特异结合；进行等位基因特异引物延伸(ASPE)反应，ASPE引物上的特定性序列能特异地识别各等位基因型，从而保证延伸引物与作为模板的酶切产物准确结合，形成延伸产物。此反应步骤如下：首先在96℃的条件下进行预变性2 min，打开DNA双链，然后在94 ℃的条件下变性30 s, 在52 ℃的条件下退火1 min, 最后在74 ℃进行延伸2 min, 后3步反复进行共计40次。随后将微球和杂交液混合液45 μL涡旋30 s, 使微球充分混合后放入96孔板中，再加入ASPE产物5 μL, 进行杂交反应，在杂交孔中加入SA-PE 25 μL进行孵育，使引物上的Tag序列标签同聚苯乙烯微球上的Anti-Tag序列互补配对。最后是读取数据，将杂交后的微球放置于Luminex阅读仪上进行数据读取和分析，根据样品的中位荧光值(MFI)判断检测基因是否发生突变。

1.2.3EGFR基因表达检测：对组织样品采用分支-DNA液相芯片法检测基因表达水平，具体实验步骤如下：① 用裂解液与样本在56 ℃的环境中下持续反应2 h，使用超微量核酸蛋白分析仪测定信使核糖核酸纯度。② 将支持延伸探针、支持探针-微球、样本裂解液及缓冲液加入到孵育板，在55 ℃的条件下持续震荡。③ 次日再把孵育板置于磁力架1 min, 使样本液中磁性微球聚集于下方，将上清吸取去除。④ 将洗涤液加入样本中进行震荡，持续1 min，并再次将孵育板置于磁力架1 min后弃除上清，此步骤重复3遍。⑤ 将标记探针及扩增延伸探针放入孵育板中，于56 ℃的条件下持续反应1 h。将步骤3重复2遍。⑥ 加入SA-PE震荡，在50℃的条件下持续30 min。重复步骤6。再次使用洗涤液，持续反应5 min后，放置在Luminex 阅读仪上进行数据读取和分析，取得mRNA检测表达结果。判读mRNA表达水平的方法为：用高、中、低3个等级来表示检验结果，表达水平<25%判读为低表达，表达水平在25%～75%判读为中表达，表达水平>75%判读为高表达。评判标准是根据广州益善生物检验所建立的中国肺癌人群数据库所确定的。

1.3统计学分析

所有数据使用SPSS 19.0软件录入数据建立数据库，并对所得数据进行统计学分析。EGFR基因突变及表达水平情况采用描述性统计分析方法，用χ2检验和Kruskal-Wallis秩检验进行EGFR基因亚型突变与各临床因素之间的比较，用Spearman相关分析法计算EGFR基因表达水平与各临床因素相关系数R，分析其相关程度。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1NSCLC患者的临床资料及EGFR基因突变、表达水平情况

本研究共有128例NSCLC患者。突变检测结果提示，61例患者发生基因突变，总体突变率为47.7%，其中27例发生19外显子突变，34例发生21外显子突变，无18外显子突变及20外显子突变病例。所有基因突变均为单发，未发生2个及以上基因同时突变的情况。EGFR E19野生型占78.9%(101/128)，EGFR E21野生型占73.4%(94/128)。对入组患者的EGFR基因表达水平进行测定，按照判读方法将基因表达值分为高、中、低3个级别，其中高表达36例(28.1%)，中表达65例(50.8%)，低表达27例(21.1%)。EGFR基因表达水平中位数为0.562，均值为0.675，标准差为0.560，最小值为0.039，最大值为3.994，正态检验统计量为0.815，P<0.0001。

2.2EGFR E19、E21基因突变与NSCLC患者临床参数的差异性分析

在128例NSCLC患者中，无吸烟史患者EGFR E19基因突变率为37.3%，而有吸烟史的患者突变率为5.8%，差异有统计学意义(P<0.05)；在患者年龄、性别、病理类型、分化程度、TNM分期等比较中，EGFR E19基因突变差异无统计学意义(P>0.05)。腺癌患者中的EGFR E21基因突变率为44.7%，非腺癌患者的E21基因突变率为0.0%；肿瘤高分化患者的EGFR E21突变率为100%，中、低分化的患者的突变率分别为22.6%、5.9%，差异均有统计学意义(P<0.01)。说明肿瘤分化高的腺癌患者更可能产生EGFR E21基因突变。见表1。

表1　EGFR E19基因突变情况与临床参数的差异性分析

与野生型比较, *P<0.05, **P<0.01。

2.3EGFR基因突变与NSCLC患者临床参数的相关性分析

对于EGFR基因突变与临床参数的相关性，作者应用Spearman秩和相关分析进行统计。数据分析显示，EGFR基因19外显子突变与吸烟史有显著相关性(r=0.238,P<0.01)，表明EGFR E19基因在无吸烟史患者中的突变率高于有吸烟史的患者。EGFR基因21外显子发生突变与肿瘤病理类型和肿瘤分化程度都呈现相关性(r=-0.213、-0.190,P<0.05)，表明腺癌患者、肿瘤分化程度越高的患者较其他患者发生EGFR E21基因突变的概率更高。见表2。

表2　EGFR基因突变与NSCLC 患者临床参数相关性分析

2.4EGFR基因表达水平与NSCLC患者临床参数的关系

对EGFR基因表达水平与各临床参数的相关性进行Spearman秩相关分析。数据分析显示，EGFR基因的表达水平和病理类型呈现显著相关性(r=0.244,P<0.01)，说明EGFR表达水平在非腺癌患者中偏低，而在腺癌患者中较高。见表3。

表3　EGFR、VEGFR-2基因表达水平与临床参数的关系

3讨论

EGFR是一种受体酪氨酸蛋白激酶，共包含28个外显子，位于第7号染色体p13-q22区，能够编码1 186个氨基酸，相对分子质量为170 KDa, 被归为表皮生长因子家族。EGFR广泛分布在各种上皮细胞的细胞膜上，胞外为配体结合区，能够与可溶性或膜结合的多肽或蛋白类激素结合；细胞膜之间为跨膜疏水区；胞内为酪氨酸激酶区，能够与联结蛋白(adaptor)GrB2和SOS相结合。EGFR过度表达和自我激活可能会导致癌症细胞增殖、凋亡、浸润和转移，刺激和诱导肿瘤新生血管的形成[4]。EGFR的过度表达在NSCLC、乳腺癌、胃肠道肿瘤、前列腺癌、头颈鳞癌等多种恶性肿瘤组织中均能得到证实。目前很多学者建议将EGFR基因在肿瘤组织中的表达及变异联合起来进行检测判断，以指导NSCLC患者的靶向治疗及预后判断。

有研究[5]统计中国非小细胞肺癌中EGFR基因突变的发生率为34.0%。Paez等[6]报道指出18～21外显子是发生EGFR基因突变的主要位点，其中19外显子的缺失突变和21外显子的点突变占到EGFR突变的绝大部分。Kosaka等[7]也得出EGFR基因突变总数90%以上为19、21外显子突变。本组128例NSCLC患者，共有61例患者发生EGFR基因突变(47.7%)，其中19外显子突变27例，占突变总数的44.3%；21外显子突变34例，占突变总数的55.7%。

Lynch等[2]对EGFR基因突变的NSCLC患者的临床特征关系进行了分析，表明发生EGFR突变在不同性别及病理类型的病例中存在差异，女性突变发生率高于男性；腺癌的突变率高于其他病理类型。此外，非吸烟者的突变率要高于吸烟者。19、21外显子突变肺癌患者的临床病理特征的差异仍存在争议。国内学者[8]报道，19外显子突变肺癌患者相对21外显子突变肺癌患者而言，女性突变率较高。作者将EGFR 19和21外显子分别与肺癌患者年龄、性别、吸烟情况、病理类型、分化情况及TNM分期等进行统计，结果显示无吸烟史患者中有25例发生EGFR E19基因突变，突变率37.3%(25/67)；吸烟患者中有2例发生EGFR E19基因突变，突变率6%(2/34)，差异有统计学意义(P<0.05)。34例EGFR E21基因突变全部发生在腺癌患者，其中高分化患者突变率为100%，差异有统计学意义(P<0.05)。进一步相关分析发现，EGFR基因19外显子突变与吸烟史呈现显著相关性(r=0.238,P<0.01)，EGFR基因21外显子发生突变与肿瘤病理类型和肿瘤分化程度都呈现相关性(r=-0.213、-0.191,P<0.05)，与其他的临床病理特点无相关性，表明无吸烟史、腺癌患者、肿瘤分化程度越高，发生19或21外显子突变的概率更高。刘仁旺等[9]对EGFR 19和21外显子突变肺癌患者的临床特征进行比较，发现二者在性别、吸烟状况、组织类型、分期及分化程度上无显著差异。本组结果与其有差异，分析原因可能为本研究着重于19、21外显子突变患者与临床病理特征的对比，EGFR基因未发生突变的患者被排除，直接对比2组基因突变患者各参数的比例的差异。本研究发现女性患者的基因总体突变率高于男性，但差异无统计学意义(P>0.05)，可能与研究对象为基因突变亚型有关。也有部分学者[10]认为，鳞癌患者多为有吸烟史的男性，在校正了吸烟状态后进行统计分析显示EGFR突变与性别无关。Toyooka等[11]对431例NSCLC样本进行了EGFR突变和临床因素的相关性研究。在单变量分析中，在无吸烟史患者、女性及病理类型为腺癌的患者中，EGFR突变检出率要高于吸烟者、男性和非腺癌患者。进行多变量分析后发现EGFR突变只与无吸烟史、腺癌组织有关系。

研究[12-13]证实EGFR在肺癌中存在着高分布表达，表达率为40%～80%。Jeon YK等[14]报道EGFR在肺癌中的表达为53.1%～69.7%。研究[15]显示，很多患者存在EGFR的过表达或异常激活，表达率越高，肿瘤恶性度也越高，越容易发生浸润、转移。Ahn JH等[16]对65例肺癌术后患者的免疫组化结果进行统计后提出，EGFR的表达与性别、年龄、TNM分期、病理类型等临床因素均无关系。在本组实验中，128例NSCLC患者EGFR表达水平呈正偏态分布，以中表达为主，行相关性统计提示其与病理类型有显著相关性(P<0.01)，即更容易在腺癌中高表达。而在年龄、性别、分化程度等分组中，EGFR 表达水平无显著差异(P>0.05)。Brabender等[17]对83例患者手术标本用PCR技术进行基因突变分析，结果显示EGFR高表达患者的生存期较短。但Ahn JH认为EGFR在肺癌发生而非肿瘤进展方面起到影响作用，所以EGFR的表达与肺癌预后的关系不大[18-22]。

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Clinical significance of epidermal growth factor receptor expression and its subtype mutations in non-small cell lung cancer

ZHANG Jing，WANG Bin，WANG Yunxi，WANG Bo，CHU Xiangyang

(DepartmentofThoracicSurgery,GeneralHospitalofPeople’sLiberationArmy,Beijing, 100853)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the mRNA expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) and its subtype mutations in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). MethodsClinical materials of 128 NSCLC patients were collected. E18-21 mutations of EGFR and mRNA expression of EGFR in fresh specimens of tumor tissues were detected by liquid chip technology. ResultsThe mutation rate of EGFR gene was 47.7%, including 21.1% E19 gene mutation, 26.6% E21 gene mutation, 0% E18 and E20 gene mutations. There was a significant correlation between EGFR E19 gene mutation and smoking history (r=0.238, P<0.01). EGFR E21 gene mutation had correlations with tumor histological type (r=-0.213, P<0.05) and the degree of tumor differentiation (r=-0.190, P<0.05). EGFR gene expression was associated with tumor type (r=0.244, P<0.01). ConclusionEGFR mutations tend to occur in exons 19 and 21. E19 mutation easily occurs in patents without smoking history and E21 mutation easily occurs in patients with high-differentiated adenocarcinoma. EGFR gene expression is highly expressed in adenocarcinoma patients.

KEYWORDS:non-small cell lung cancer; targeted therapy; epidermal growth factor receptor

中图分类号:R 734.2

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)09-092-05

DOI:10.7619/jcmp.201609027

通信作者:初向阳, E-mail: drchu301@aliyun.com

收稿日期:2016-02-16