香蕉及土壤中吡唑醚菌酯残留的高效液相色谱分析

赵方方，谢德芳，吕岱竹

(中国热带农业科学院 分析测试中心，海南省热带果蔬产品质量安全重点实验室，海南 海口 571101)



香蕉及土壤中吡唑醚菌酯残留的高效液相色谱分析

赵方方，谢德芳，吕岱竹

(中国热带农业科学院 分析测试中心，海南省热带果蔬产品质量安全重点实验室，海南 海口 571101)

[摘要]【目的】 建立吡唑醚菌酯在香蕉和土壤中残留量的高效液相色谱检测方法。【方法】 用乙腈提取试样，分别采用Strata/NH2和Carbon/NH2固相萃取柱对香蕉中吡唑醚菌酯进行净化，对2种SPE柱进行对比，并优化其色谱条件，采用高效液相色谱-紫外检测器进行测定。【结果】 香蕉加标样品中，2种SPE柱均可与杂质较好分离；Carbon/NH2柱净化后杂质峰较少，但是目标物响应值明显降低，回收率仅为35.5%，而Strata/NH2柱净化后，回收率达到95%以上，因此选择Strata/NH2柱净化。在添加量为0.01～0.1 mg/kg时，吡唑醚菌酯在香蕉全蕉中的平均回收率为82%～96%，相对标准偏差为1.7%～2.7%；在蕉肉中的平均回收率为82%～96%，相对标准偏差为1.3%～2.7%；在土壤中的平均回收率为81%～96%，相对标准偏差为0.9%～2.2%。该方法的最低检出量为1×10-10g，最低检出浓度为0.01 mg/kg。【结论】 该方法灵敏度和准确度高，检测限低，完全满足香蕉和土壤中吡唑醚菌酯残留量的检测要求。

[关键词]香蕉；土壤；吡唑醚菌酯；高效液相色谱；农药残留

吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)是一种广谱性杀菌剂[1]，具有毒性低、活性高、对非靶标生物安全等优点，能有效防治多种作物的各类真菌病害,如白粉病、霜霉病、炭疽病等。吡唑醚菌酯主要用于谷物、水果、蔬菜等农作物上的茎叶喷雾及种子处理，在国内外已被广泛使用[2]。其中，吡唑醚菌酯在防治香蕉黑星病和叶斑病等病害中发挥了积极作用[3-4]。随着吡唑醚菌酯的广泛使用，其在香蕉及土壤中的残留问题受到广泛关注。而我国规定吡唑醚菌酯在香蕉中的最大残留限量(MRL)低至0.02 mg/kg(GB 2763-2014)。

目前，吡唑醚菌酯的检测方法主要采用气相色谱法[5]、高效液相色谱法[6-7]、气相色谱-串联质谱法[8]、液相色谱-串联质谱法[9-10]，以及表面等离子体共振生物传感技术[11]等，且主要集中在花生、草莓、大白菜、葡萄、西瓜等作物中吡唑醚菌酯的残留分析方面[12-16]。而有关香蕉及其土壤中吡唑醚菌酯的残留分析报道甚少。本研究建立了一种香蕉及其土壤中吡唑醚菌酯的高效液相色谱检测方法，以期为香蕉中吡唑醚菌酯的残留分析提供技术参考。

1材料与方法

1.1试验材料

Waters高效液相色谱仪(2489紫外检测器)；T18高速均质机(德国IKA集团)；微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；Strata/NH2固相萃取柱(55 μm,70 A)500 mg/6 mL；Carbon/NH2固相萃取柱(55 μm,70 A)500 mg/6 mL；R-210旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；万分之一天平(SHIMAZU)；吡唑醚菌酯标准品(德国 Dr．Eh-renstorfer GmbH 公司，纯度99.0%)；甲醇、乙腈、正己烷、丙酮(色谱纯)。标准储备液:准确称取吡唑醚菌酯标准品0.01 g，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配成1 000 μg/mL标准储备液，0～4 ℃保存，按需稀释。

1.2样品前处理

1.2.1提取(1)香蕉样品。称取20.0 g粉碎的香蕉样品，置于烧杯中，加入40.0 mL乙腈，2 000 r/min 高速匀浆2 min后过滤到预装有5～7 g NaCl的具塞量筒(100 mL)中，盖上塞子，剧烈振荡2 min后室温下静置30 min。吸取上清液10.0 mL 至100 mL圆底烧瓶中,于旋转蒸发仪上蒸发至干，加入5.0 mL正己烷-丙酮(60∶40，V/V)溶解混匀，待净化。

(2)土壤样品。称取20.0 g过筛的土壤样品于200 mL具塞塑料瓶中，加入40.0 mL乙腈，在往复式振荡器上振荡提取30 min，经滤纸过滤后收集滤液于预装有5～7 g NaCl的具塞量筒(100 mL)中，其余步骤同(1)。

1.2.2净化吸取5.0 mL正己烷-丙酮(60∶40，V/V)溶液分别预淋洗Strata/NH2和 Carbon/NH22种固相萃取小柱，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，立即倒入待净化液，用100 mL圆底烧瓶收集；用5.0 mL正己烷-丙酮(60∶40，V/V)冲洗圆底烧瓶残留物后淋洗萃取小柱，重复3次。收集液旋转蒸发至干，用2.5 mL甲醇定容后过0.22 μm滤膜待测。

1.3液相色谱条件

液相色谱柱：SunfireTMC18 (4.6 mm×150 mm, 5 μm)；紫外检测波长278 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL；流速1 mL/min；流动相：乙腈-水。梯度洗脱程序见表 1。

表 1　流动相梯度洗脱程序

1.4准确度与精密度测定

量取一定体积的吡唑醚菌酯标准储备液加入香蕉全蕉、香蕉蕉肉和土壤空白样品中，分别制得 0.01，0.02，0.1 mg/kg的3个添加水平，每个添加水平5次试验，同时做空白对照，按“1.2”进行样品前处理，按“1.3”条件进行检测，计算回收率及相对标准偏差。

2结果与分析

2.1提取净化条件的选择

吡唑醚菌酯是一种极性农药，在20 ℃下，二氯甲烷中溶解度≥570 mg/mL，丙酮中溶解度≥650 mg/mL，乙腈中溶解度≥500 mg/mL；但由于二氯甲烷沸点较低，对环境和实验人员污染较大，丙酮毒性低，但其共萃物较多，因此，选择乙腈作为提取溶剂。对样品的净化，本研究选用Strata/NH2和Carbon/NH2固相萃取柱。香蕉全蕉加标0.1 mg/kg 及空白样品的净化色谱图如图1所示。由图1可知，2种固相萃取柱均可与杂质较好分离；Carbon/NH2固相萃取柱净化后杂质峰较少，但是目标物的响应值(峰面积)明显降低，回收率仅为35.5%，而Strata/NH2柱净化后，回收率达到95%以上，因此选择Strata/NH2柱净化。

图 1　Strata/NH2和Carbon/NH2固相萃取柱净化香蕉样品中吡唑醚菌酯的色谱图

2.2HPLC条件的优化

吡唑醚菌酯在紫外检测波长278 nm 时响应值最大，0.01 μg/mL的标准溶液出峰明显，S/N(标准溶液信号/噪音)>3。

吡唑醚菌酯标准溶液、香蕉全蕉、香蕉蕉肉和土壤的空白样品及添加回收样品的液相色谱图见图2。样品先以V(乙腈)∶V(水)=65∶35为流动相运行9 min，再调整其体积比为90∶10进行测定，吡唑醚菌酯在香蕉全蕉、蕉肉和土壤中均与杂质得到了良好的分离(图2-B、C、D)，吡唑醚菌酯的保留时间为7.237 min。

图 2　吡唑醚菌酯标准溶液、香蕉全蕉和蕉肉及土壤样品中吡唑醚菌酯的色谱图

2.3标准曲线及线性范围

用甲醇做溶剂，逐级稀释标准储备液，分别配成0.01，0.025，0.05，0.10，0.25，0.50 μg/mL标准溶液进样分析，采用外标法定量峰面积。以吡唑醚菌酯标准溶液质量浓度x(μg/mL)为横坐标，以相应峰面积y为纵坐标绘制工作曲线。吡唑醚菌酯标准曲线回归方程为:y=40 404x+91.411，相关系数为0.999 9，在0.01～0.50 μg/mL内线性范围良好 (图3)。

2.4方法的准确度和精密度

香蕉全蕉、蕉肉和土壤样品中添加吡唑醚菌酯的回收率及相对标准偏差的结果见表2。由表2可知，3个添加水平在香蕉全蕉中的平均回收率为82%～96%，相对标准偏差为1.7%～2.7%，在蕉肉中的平均回收率为82%～96%，相对标准偏差为1.3%～2.7%，在土壤中的平均回收率为81%～96%，相对标准偏差为0.9%～2.2%。回收率以及相对标准偏差均在《农药残留试验准则》[17]允许范围内，说明方法的准确度和精密度可满足吡唑醚菌酯残留检测的要求。

图 3　吡唑醚菌酯标准曲线

2.5最低检出量与最低检出浓度

以一定量的吡唑醚菌酯标准溶液(进样量10 μL)进样，以3倍信噪比所需的待测物浓度计算，吡唑醚菌酯最低检出量为1×10-10g。在香蕉空白样品中添加一定量的吡唑醚菌酯标准溶液，按10倍信噪比所需的待测物浓度计算(以mg/kg为单位)，最低检出浓度为0.01 mg/kg，完全满足香蕉中吡唑醚菌酯农药残留限量的检测要求(GB 2763-2014中规定吡唑醚菌酯在香蕉中的最大允许残留限量为0.02 mg/kg)。

3讨论

本研究采用Waters高效液相色谱仪(2489紫外检测器)，经过优化对比，建立了香蕉全蕉、蕉肉及土壤中吡唑醚菌酯的提取净化、检测方法。由于吡唑醚菌酯极性较强，对香蕉样品中吡唑醚菌酯的提取，常选用丙酮、二氯甲烷、乙腈作为提取溶剂。其中丙酮毒性较低，但共萃物较多，二氯甲烷毒性与乙腈相当，但二氯甲烷沸点低，对实验人员和环境危害较大，因此选择乙腈作为提取溶剂，而且乙腈在饱和NaCl 溶液的存在下可增强其离子化效应，使其与水更好更快地分层，同时也使农药目标物更完全地溶于乙腈中，除去溶于水的一部分干扰杂质，以便进行下一步的净化。

对样品的净化，本研究选用Strata/NH2和Carbon/NH2固相萃取柱。由试验结果可知，Carbon/NH2固相萃取柱净化后杂质峰较少，但是目标物的峰面积明显降低，回收率仅为35.5%，这可能是因为Carbon/NH2固相萃取柱内填充了高纯的石墨化碳颗粒，可同时降低干扰物及目标物的响应值，因此，本试验选择Strata/NH2固相萃取柱，该柱对香蕉样品中吡唑醚菌酯具有良好的净化效果，回收率完全满足农药残留分析的要求。

标准品不同质量浓度的测定结果表明，当进样质量浓度为0.01～0.50 μg/mL时，吡唑醚菌酯峰面积与标准品质量浓度之间有良好的线性关系，回归方程为y=40 404x+91.411(R2=0.999 9)。吡唑醚菌酯在香蕉全蕉中的添加回收率为82%～96%，相对标准偏差为1.7%～2.7%；在蕉肉中的添加回收率为82%～96%，相对标准偏差为1.3%～2.7%；在土壤中的添加回收率为81%～96%，相对标准偏差为0.9%～2.2%，满足吡唑醚菌酯残留检测的要求。在设定的色谱条件下，样品的最低检出量为1×10-10g，最低检出浓度为0.01 mg/kg，完全满足香蕉中吡唑醚菌酯农药残留限量的检测要求(GB 2763-2014中规定吡唑醚菌酯在香蕉中的最大允许残留限量为0.02 mg/kg)。

4结论

本研究建立的香蕉全蕉、蕉肉及土壤中吡唑醚菌酯的检测方法，灵敏度和精密度高，净化效果和重复性好。参照国家香蕉中吡唑醚菌酯的残留限量标准，本方法完全适用于香蕉及土壤中吡唑醚菌酯残留分析，同时也为其他作物中吡唑醚菌酯残留分析提供了依据。

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Determination of residual pyraclostrobin in banana and soil by HPLC

ZHAO Fang-fang,XIE De-fang,LÜ Dai-zhu

(Analysis&TestingCenter,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,HainanProvincialKeyLaboratoryofQualityandSafetyforTropicalFruitsandVegetables,Haikou,Hainan571101,China)

Abstract:【Objective】 An analysis method for pyraclostrobin detection in banana and soil by HPLC (High performance liquid phase chromatography) was established.【Method】 Samples were extracted with acetonitrile and cleaned up using the Strata/NH2 and Carbon/NH2 SPE columns.The results with the two solid phase extraction columns were compared and the chromatographic conditions for pyraclostrobin in banana and soil were optimized before samples were injected to the HPLC-UV (High performance liquid phase chromatography-Ultra-violet detector) for analysis.【Result】 Pyraclostrobin and impurity had better separation with the two SPE columns in the spiked samples.The impurity was less but the target response decreased (the value of recovery was 35.5%) with Carbon/NH2 SPE column.The values of recovery were higher than 95% with Strata/NH2 SPE column.Thus,Strata/NH2 SPE column was selected.Values of RSD,S in the whole fruit were 1.7%-2.7%,and values of recovery were 82%-96% with additive amount of 0.01-0.1 mg/kg.Similarly,values of RSD,S in flesh were 1.3%-2.7% and values of recovery were 82%-96%.Values of RSD,S in soil were 0.9%-2.2% and values of recovery were 81%-96%.The detection limit of this method for pyraclostrobin was 1×10-10g and the quantitation limit was 0.01 mg/kg.【Conclusion】 The method could be used to detect pyraclostrobin in banana and soil due to its high sensitivity,high accuracy and low detection limit.

Key words:banana;soil;pyraclostrobin;HPLC;pesticide residue

[文章编号]1671-9387(2016)01-0097-05

[中图分类号]TQ450.2+63；S481+.8

[文献标志码]A

[作者简介]赵方方(1987-)，女，山东济宁人，研究实习员，硕士，主要从事农药残留试验研究。E-mail:zhaofangfang@163.com

[基金项目]农业部农药残留试验项目(2013F285)；中国热带农业科学院分析测试中心主任基金项目(2013-01)

[收稿日期]2014-06-03

DOI：网络出版时间:2015-12-0214:2510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.01.015

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151202.1425.030.html