猪NR4A1基因的克隆、序列分析及表达模式研究

刘林清,李凤娥,熊远著,邓昌彦

(1 安徽省农业科学院 畜牧兽医研究所，安徽 合肥 230031；2 华中农业大学 动物科学院，湖北 武汉 430070)



猪NR4A1基因的克隆、序列分析及表达模式研究

刘林清1,李凤娥2,熊远著2,邓昌彦2

(1 安徽省农业科学院 畜牧兽医研究所，安徽 合肥 230031；2 华中农业大学 动物科学院，湖北 武汉 430070)

[摘要]【目的】 克隆猪核受体4A1 (Nuclear receptor subfamily 4,group A,member 1,NR4A1) DNA序列全长，并对CDS序列及其表达模式进行分析。【方法】 以未成年长大母猪的卵巢为材料，采用电子克隆技术，对猪NR4A1 DNA序列进行分离和测序，并对猪NR4A1基因序列进行生物信息学分析；利用性腺激素(人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，HCG)和孕马血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG))处理卵巢颗粒细胞,采用RT-PCR方法分析猪NR4A1基因的表达模式。【结果】 获得猪NR4A1 基因4 870 bp 的DNA序列,其中CDS全长序列为1 734 bp，共编码572个氨基酸；猪NR4A1基因编码的氨基酸序列与人的对应氨基酸序列的相似性最高(97%)，其次为小鼠(94%)；Expasy软件预测结果表明，NR4A1蛋白的氨基酸序列非常保守，其中包含2个锌指特征(NR C4-type)，一个是激素受体超家族，另一个是Zf-C4超家族；猪卵巢颗粒细胞在性腺激素处理后，可诱导猪NR4A1基因在卵泡发育和排卵时期瞬时表达。【结论】 猪NR4A1基因的CDS区在物种间保守性较强，推测猪NR4A1基因调节卵泡的发育和排卵过程。

[关键词]猪；NR4A1；序列分析；表达模式

NR4A1基因作为一个孤核受体的转录因子，编码类固醇-甲状腺激素超家族。NR4A1蛋白是一类配体依赖转录调节蛋白[1]，它在转录过程中起作用的是N-末端，参与调节核定位和转录激活过程的是C-末端[2-4]。在细胞中进行的类固醇合成活性研究结果显示，NR4A1基因表达与P450胆固醇侧链裂解酶(Cytochrome P450 side chain cleavage enzyme，P450scc)[5]和类固醇合成重要调节蛋白[6]的空间表达模式相一致。许多研究者还指出，其他编码类固醇生成酶的基因，如细胞色素P450 11A1(Cytochrome P450,family 11,subfamily A,polypeptide 1 ,CYP11A1)、细胞色素P450 11B1(Cytochrome P450,family 11,subfamily B,polypeptide 1,CYP11B1)和细胞色素P450 19(Cytochrome P450, family 19,CYP19)，它们的启动子上存在与NR4A1基因相似的NBRE序列[7-8]。随着更进一步的研究发现，NR4A1基因可以提高20α-羟基类固醇脱氢酶(20α hydroxysteroid dehydrogenase，20α HSD)在黄体中的转录活性[9]。从基因的功能方面入手，研究者发现NR4A1基因的表达显著抑制了子宫肌瘤的发生[10]，并且NR4A1基因的信号在许多癌症中表现出失调现象，被认为是构成靶向药物的重要分子[11]。此外，还有研究者利用原位杂交方法分析认为，在注射促黄体激素(Luteinizing hormone,LH)/人绒毛膜促性腺激素(HCG)后，可诱导NR4A1基因在卵巢排卵前卵泡颗粒层细胞中快速、短暂的表达[12-13]。从上述研究结果可以看出，NR4A1基因可能调节卵泡的发育，在排卵过程中发挥着重要作用。因此，对NR4A1基因进行深人研究，探索其在不同时间点性腺激素处理卵巢细胞中的表达情况具有重要意义。因此，本研究采用电子克隆技术，对猪NR4A1 DNA序列进行了分离和测序，并对猪NR4A1基因序列进行了生物信息学分析；最后，利用RT-PCR方法分析了猪NR4A1基因在性腺激素处理后卵巢颗粒细胞中的表达模式，为更进一步阐明NR4A1基因的繁殖性能奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

试验所需的卵巢组织样本采自华中农业大学精品种猪场的3头未成年长大母猪。其中，一部分卵巢组织提取猪基因组DNA，用于候选基因的DNA序列分离鉴定；另一部分采集卵泡液，用于猪卵巢颗粒细胞的培养。

1.2引物的设计与合成

首先参照GenBank中人NR4A1 (GenBank登录号NM_002135.3)基因序列，利用NCBI EST-others或Sus scrofa数据库搜寻到4个与猪同源序列(DB781566.1、EW505383.2、EW445784.2、EW506402.2)，然后将获得的序列进行拼接，以此为模板，利用Premier 5.0软件设计NR4A1基因引物(N1F/N1R、N2F/N2R、N3F/N3R、N4F/N4R)及半定量引物(NBF/NBR)。NR4A1基因表达模式分析时以GAPDH基因为内参,其引物为GAPDHF/GAPDHR。试验所用引物均由上海生物工程公司合成，详见表1。

表 1　NR4A1基因引物及半定量引物

1.3猪NR4A1基因的克隆及测序

参照熊远著[14]的方法提取猪卵巢组织基因组DNA。PCR反应总体系：0.2 mmol/L dNTP，1.5～2.0 μmol/L引物(N1F/N1R、N2F/N2R、N3F/N3R、N4F/N4R)，1×Buffer,200 ng DNA模板，1 UTaqDNA聚合酶，加纯净水至25 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，退火30 s，各引物的退火温度见表1，72 ℃延伸35～120 s,共计35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用胶回收试剂盒获得目的片段，与pMD-18T载体连接，转化到DH5a，通过白斑菌落筛选进行PCR扩增，扩增产物送上海生物工程公司测序，测序结果用DNAstar软件的SeqMan程序进行序列拼接。

1.4猪NR4A1基因的序列分析

NR4A1基因编码氨基酸序列的同源性比较采用Blustal W程序；氨基酸序列及特征分析通过ExPASy(http：//cnexpasy.org)来预测。

1.5NR4A1基因表达模式的分析

1.5.1卵巢颗粒细胞的分离、培养取3头未成年长大母猪卵巢，采集卵泡液，参照乐凯[15]的方法培养猪卵巢颗粒细胞，在培养24 h后，其培养基更换为2 mL DMEM/F12+2 IU PMSG(孕马血清促性腺激素)+1 IU HCG(人绒毛膜促性腺激素)继续进行培养，分别在培养后0，2，4，8，12，16，20，24 h收集细胞，提取RNA，用于RT-PCR分析。

1.5.2猪卵巢颗粒细胞总RNA的提取及反转录猪卵巢颗粒细胞总RNA的提取采用Tizol一步法，并将总RNA参照刘林清[16]的方法进行反转录。

1.5.3NR4A1基因在猪卵巢颗粒细胞的表达以GAPDH基因为内参，以cDNA为模板进行 RT-PCR 扩增。PCR反应总体系为25 μL：1 UTaqDNA聚合酶，0.2 mmol/L dNTP，1.5～2.0 μmol/L 特异引物(NBF/NBR)，50 ng cDNA模板，1×Buffer,加纯净水至25 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s ，63.1 ℃退火30 s，72 ℃延伸300 s,共计30个循环；72 ℃延伸10 min。

2结果与分析

2.1猪NR4A1基因的克隆

用N1F/N1R、N2F/N2R、N3F/N3R、N4F/N4R引物进行PCR扩增，结果见图1。扩增产物经回收纯化后测序，结果显示分别扩增到826，1 150，1 451和2 060 bp的片段。用DNAstar软件的SeqMan程序进行序列拼接，得到1条包含CDS序列及整个内含子序列的共4 870 bp的DNA序列，GenBank登录号：FJ548760。

图 1猪NR4A1基因PCR扩增结果

M.DL2000 Marker；1.引物N1F/N1R的扩增产物；2.引物N2F/N2R的扩增产物；

3.引物N3F/N3R的扩增产物；4.引物N4F/N4R的扩增产物

Fig.1PCR amplification of porcineNR4A1 gene

M.DL2000 Marker;1.Product of N1F/N1R;2.Product of N2F/N2R;

3.Product of N3F/N3R;4.Product of N4F/N4R

2.2猪NR4A1基因的序列分析

ORF Finder软件分析结果表明，猪NR4A1基因ORF为1 734 bp，编码572个氨基酸。采用Blustal W程序对猪、人、小鼠3种动物NR4A1基因编码的氨基酸序列的同源性进行比较，结果(图2)显示，该序列与人NR4A1 (GenBank登录号:NM_002135.3)和小鼠NR4A1 (GenBank登录号:NM_010444.1)基因编码的氨基酸序列相似性分别为97%和94%，表明该蛋白的氨基酸序列非常保守。

图 2　NR4A1蛋白氨基酸序列比对结果

通过ExPASy(http：//cnexpasy.org)预测猪NR4A1蛋白的结构，结果显示，该蛋白包含主要的2个锌指特征(NR C4-type)，一个是激素受体超家族，另一个是Zf-C4超家族。

2.3猪卵巢颗粒细胞中NR4A1基因的表达情况

猪卵巢颗粒细胞经性腺激素PMSG和HCG处理后，不同时间收集细胞，提取RNA，反转录成cDNA，利用引物NBF/NBR、GAPDHF/GAPDHR进行RT-PCR扩增，结果见图3。由图3可知，PMSG和HCG加入猪颗粒细胞后2 h，NR4A1基因达到显著性表达，之后迅速下降直到不表达，16 h以后又有微量表达。

图 3　RT-PCR方法检测猪NR4A1基因在卵巢颗粒细胞中的表达情况

3讨论

本研究结果显示，NR4A1基因编码的氨基酸序列在不同物种间相似性很高，表明该蛋白的氨基酸序列非常保守。本研究通过ExPASy预测猪NR4A1蛋白的结构，发现其包含主要的2个锌指特征(NR C4-type)，一个是激素受体超家族，另一个是Zf-C4超家族。以上的预测结果与其他研究者的结论[2,4]相符合。

对NR4A1基因在猪卵巢颗粒细胞中表达模式的研究发现，在性腺激素处理后，可诱导猪NR4A1基因在卵泡发育和排卵时期瞬时表达，与Park等[12-13]的研究结果是一致的。推测猪NR4A1基因调节卵泡的发育和排卵过程。

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[15]乐凯．猪ADAMTS1基因分离、定位以及对其表达规律、遗传效应和调控机理的研究 [D].武汉：华中农业大学，2008.

Yue K.Cloning,radiation hybrid mapping,promoter regulation and genetics effect analysis of porcine adamis1 gene [D].Wuhan:Huazhong Agricultural University,2008.(in Chinese)

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Liu L Q.Isolation,identification and initial functional analysis of porcineHSD17B1,NR4A1,ALAS1 genes [D].Wuhan:Huazhong Agricultural University,2009.(in Chinese)

Cloning,sequence analysis and expression pattern of porcineNR4A1 gene

LIU Lin-qing1,LI Feng-e2,XIONG Yuan-zhu2,DENG Chang-yan2

(1InstituteofHusbandryandVeterinaryMedicine,AnhuiAcademyofAgriculturalSciences,Hefei,Anhui230031,China;2CollegeofAnimalScience,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei430070,China)

Abstract:【Objective】 The genomic sequence of porcine NR4A1 gene was cloned and the temporal and spatial expression patterns were studied.【Method】 Using ovary of minor sow as material,the structure of the porcine NR4A1 gene was analyzed by bioinformatics methods.The expression patterns of NR4A1 gene were analyzed by RT-PCR after ovarian granulosa cells were treated with pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) and human chorionic gonadotropin (HCG).【Result】 The genomic sequence with 4 870 bp of NR4A1 gene was obtained,which contained 1 734 bp CDS and encoded 572 amino acids.The amino acid sequences exhibited the greatest identity with human (97%),followed by house mouse (94%).Expasy software estimation showed that NR4A1 protein was conservative including 2 NR C4-type,one was hormone receptor superfamily and the other was Zf-C4 superfamily.The porcine NR4A1 gene had a rapid expression pattern after granulose cells were treated with PMSG/HCG.【Conclusion】 NR4A1 gene was highly conservative among species and it involved in the regulation of follicular development,ovulation and e luteinizing process.

Key words:pig;NR4A1;sequence analysis;expression pattern

[文章编号]1671-9387(2016)01-0014-05

[中图分类号]Q785

[文献标志码]A

[作者简介]刘林清(1980-)，女，山东莱芜人，助理研究员，博士，主要从事猪的遗传育种研究。E-mail:liulinqingllq@126.com[通信作者]邓昌彦(1949-)，男，湖北武汉人，教授，学士，博士生导师，主要从事动物分子遗传学与育种和畜牧环境生物工程研究。

[基金项目]安徽省农业科学院科技创新团队项目(13C0405)；安徽省农业科学院院长青年基金项目(14B0427)

[收稿日期]2014-04-25

DOI：网络出版时间:2015-12-0214:2510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.01.003

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151202.1425.006.html