FoxM1靶向调控bcl-2促进急性髓系白血病发生*

陈 谨， 王晓明， 周敏然， 孙 婷， 陈忠敏， 陈春燕△

(1安徽医学高等专科学校，安徽 合肥 230601； 2山东大学齐鲁医院血液科，山东 济南 250012； 3重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)

FoxM1靶向调控bcl-2促进急性髓系白血病发生*

陈 谨1， 王晓明2， 周敏然2， 孙 婷2， 陈忠敏3， 陈春燕2△

(1安徽医学高等专科学校，安徽 合肥 230601；2山东大学齐鲁医院血液科，山东 济南 250012；3重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)

目的：探讨叉头框蛋白M1(FoxM1)及其调控的原癌基因B细胞白血病/淋巴瘤-2(bcl-2)在急性髓系白血病(AML)发生中的作用。方法: RT-qPCR和免疫荧光方法检测17例AML初诊患者、17例治疗后达完全缓解(CR)患者、17例难治复发(RR)患者和15例正常骨髓标本中FoxM1的mRNA和蛋白表达；转染FoxM1 siRNA和对照siRNA至白血病HL60细胞和K562细胞，观察FoxM1对细胞生长和克隆形成的影响，流式细胞术检测FoxM1对凋亡的影响，RT-qPCR和Western blot法检测FoxM1对Bcl-2表达的影响，双萤光素酶活性实验检测FoxM1是否可以靶向作用于bcl-2启动子区域进而影响Bcl-2的表达。结果: AML初诊患者骨髓标本的FoxM1表达较正常对照显著升高，CR患者的FoxM1表达较初诊组降低，RR组的FoxM1表达较初诊组进一步升高。转染FoxM1 siRNA沉默HL60细胞和K562细胞的FoxM1表达后，细胞生长速率显著下降，细胞克隆形成能力显著降低，细胞凋亡率显著升高，bcl-2表达降低，FoxM1可靶向调控bcl-2。结论: 初步证实FoxM1可通过靶向调控bcl-2促进AML发生发展，干扰FoxM1表达可抑制细胞增殖并促进细胞凋亡，提示FoxM1是治疗AML的潜在靶标。

急性髓系白血病； 叉头框蛋白M1； Bcl-2

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是成年人最常见的急性白血病，现有的治疗方案效果不佳，如以蒽环类和阿糖胞苷为主的联合化疗是非急性早幼粒细胞白血病的AML的主要治疗方法，60岁以下患者的5年生存率仅为30%～40%，60岁以上的5年生存率<10%[1]。因此，深入研究AML发生发展的机制，发现新的潜在靶标是重要基础性科学问题。

叉头框蛋白M1(Forkhead box M1，FoxM1)是在有丝分裂G1/S和G2/M期中起正向调控的转录因子，促进细胞有丝分裂和增殖，已发现在一些实体瘤中FoxM1过度表达，通过诱发细胞异常增殖参与恶性转化，由于FoxM1在正常成熟组织细胞不表达，因此FoxM1被认为是抗肿瘤的潜在靶标[2]，然而，FoxM1在急性白血病中作用的研究报道较为少见[1, 3-4]。Bcl-2通过抑制细胞凋亡促进恶性进展，是细胞凋亡研究中最受重视的癌基因之一，FoxM1能否调控Bcl-2发挥生物学效应值得关注。有鉴于此，本研究拟探讨FoxM1及其调控Bcl-2的机制及其在AML发生发展中的作用，为发现AML的新靶标提供初步依据。

材 料 和 方 法

1 主要试剂

人淋巴细胞分离液购自中国上海泛柯实业有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和RPMI-1640培养基购自Gibco；HL60细胞株由本实验室保存；K562细胞株购自北京北纳创联生物技术研究院；FoxM1 siRNA和对照siRNA购自Sigma；转染试剂LipofectamineTM2000和RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen；逆转录试剂盒购自Fermentas；PCR引物由深圳华大基因科技有限公司合成；RT-qPCR试剂盒购自TaKaRa；Western blot相关试剂购自北京索莱宝科技有限公司；FoxM1和Bcl-2抗体购自Santa Cruz；ECL化学发光检测试剂盒购自Millipore；细胞免疫荧光试剂丙酮购自中国天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；Triton X-100购自中国北京索莱宝科技有限公司；抗兔辣根过氧化物酶标记的 II 抗购自Abcam；凋亡检测试剂盒购自BD。

2 急性髓系白血病患者骨髓标本的获取

随机采集17例AML初诊(denovo)患者、17例治疗后达完全缓解(complete remission，CR)患者、17例难治复发(refractoriness and relapse，RR)患者和15例正常骨髓标本4～5 mL，置于EDTA抗凝管，使用人淋巴细胞分离液处理标本，分离单个核细胞后存放于-80 ℃冰箱中待用。

3 方法

3.1 RT-qPCR检测FoxM1和Bcl-2的mRNA表达水平 0.5～1 mL TRIzol处理骨髓单个核细胞或白血病细胞系，提取总RNA。使用随机引物和MMLV逆转录酶进行反转录，按照程序65 ℃ 5 min、25 ℃ 5 min、42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min合成cDNA。获得cDNA后，使用SYBR Green RT-qPCR试剂盒建立PCR体系，按照程序95 ℃ 10 s；95℃ 5 s、60 ℃ 31 s，40个循环进行PCR。qPCR的引物序列见表1。

表1 引物序列和siRNA序列

Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR and the sequences of the siRNA

NC: negative control.

3.2 细胞免疫荧光实验检测骨髓标本FoxM1和Bcl-2蛋白表达 将提取的AML患者和正常对照骨髓中单个核细胞，涂片，丙酮固定，置于4 ℃冰箱，PBS润洗、细胞打孔、山羊血清封闭30 min，加 I 抗FoxM1(1∶150)和Bcl-2(1∶100)4 ℃孵育过夜，PBS润洗， II 抗孵育(1∶1 000)，PBS润洗，DAPI孵育，然后抗淬灭剂孵育，最后拍照保存。

3.3 细胞培养及转染实验 白血病细胞系HL60和K562用10% FBS和RPMI-1640培养基，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。将HL60细胞和K562细胞以每孔1×105接种到6孔板中后，配置混合液(250 μL Opti-MEM+5 μL LipofectamineTM2000；250 μL Opti-MEM+5 μLFoxM1/NC siRNA)，5 min后将两者混合形成转染复合物(500 μL Opti-MEM+5 μL LipofectamineTM2000+5 μLFoxM1/NC siRNA)，20 min后将转染复合物加入每孔细胞中，孵育72 h后，收集细胞进行相关检测。siRNA序列见表1。

3.4 细胞生长曲线测定 分别转染FoxM1 siRNA或对照siRNA到白血病细胞HL60和K562，在转染0 h、24 h、48 h、72 h时分别进行细胞计数，绘制细胞生长曲线。

3.5 软琼脂克隆形成实验 将1%下层琼脂与20% FBS和2×RPMI-1640培基按照1∶1比例配置13 mL，均匀加入6孔板(每孔2 mL)。待下层琼脂培养基凝固后，将0.3%或0.4%上层琼脂与HL60/K562细胞悬液按照1∶1的比例配制7 mL，将含有细胞的上层培养基均匀加入6孔板。待上层琼脂凝固后，将6孔板置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育，约15 d后观察白色致密不透光细胞团的数目及大小。

3.6 流式细胞术测定细胞凋亡率 将1×106已转染FoxM1/NC siRNA的HL60细胞和K562细胞用PBS清洗后，用100 μL 结合缓冲液重悬细胞后放入5 mL流式管中。加入PE标记的5 μL Annexin V，再加入5 μL 7-AAD，15 min后再加入400 μL 结合缓冲液均匀混合后用流式细胞仪测定细胞凋亡率。

3.7 双萤光素酶活性检测 使用Lipofectamine 2000分别将bcl-2启动子质粒和FoxM1/NC siRNA及内参照pRL-TK质粒同时转染细胞，作用48 h后，进行双萤光素酶活性检测。双萤光素酶活性检测按双萤光素酶活性检测试剂盒说明进行。

4 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示。多组间的差异采用单因素方差分析进行比较，两组均数间比较采用t检验，以P<0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 急性髓系白血病初诊和难治复发患者FoxM1表达升高

用RT-qPCR方法和免疫荧光技术检测17例AML-denovo患者、17例AML-CR患者、17例AML-RR患者和15例正常骨髓标本中FoxM1的mRNA和蛋白表达。结果显示，与正常健康对照骨髓标本相比，AML-denovo组患者骨髓标本中FoxM1表达显著升高，而AML-CR组 FoxM1表达较初诊组降低，AML-RR组 FoxM1表达较初诊组进一步升高，表明FoxM1与AML的发生发展和治疗转归密切相关，见图1。

Figure 1. FoxM1 was over-expressed in AML. A: the mRNA expression of FoxM1 in BM samples from the patients in different groups detected by RT-qPCR analysis; B: the protein expression of FoxM1 in BM samples from the patients in different groups determined by cellular immunofluorescence analysis. Mean±SD.n=17.*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsAML-denovo.

图1 急性髓系白血病患者骨髓标本中FoxM1表达升高

2 干扰FoxM1表达抑制白血病HL60和K562细胞增殖

转染FoxM1 siRNA到HL60和K562细胞，转染0 h、24 h、48 h、72 h后分别计数活细胞，绘制细胞生长曲线，结果表明，转染FoxM1 siRNA组较转染对照siRNA组的HL60和K562细胞增殖速率显著降低。转染FoxM1 siRNA 72 h后进行软琼脂克隆形成实验，14 d后观察结果显示，转染FoxM1 siRNA组较转染对照siRNA组的HL60细胞和K562细胞克隆形成能力显著降低，提示干扰FoxM1表达可抑制白血病细胞增殖，见图2。

3 干扰FoxM1表达促进白血病HL60和K562细胞凋亡

转染FoxM1 siRNA到HL60细胞和K562细胞，72 h后收集细胞，流式细胞术检测发现与对照siRNA组相比较，FoxM1 siRNA组的凋亡率明显升高，表明干扰FoxM1表达可促进白血病细胞凋亡，见图3。

Figure 2.FoxM1 specific siRNA inhibited the proliferation of HL60 cells (A) and K562 cells (B). Foci formation (C) of HL60 cells and K562 cells after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC siRNA.

图2 干扰FoxM1表达可抑制HL60和K562细胞增殖

Figure 3.Silencing ofFoxM1 promoted the apoptosis of HL60 cells and K562 cells.FoxM1 specific siRNA was transfected into the HL60 cells and K562 cells. The cells were harvested 72 h after transfection. Flow cytometry was performed with Annexin V-phycoerythrin (PE) and 7-aminoactinomycin (7-AAD) double staining.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC siRNA.

图3 干扰FoxM1表达促进HL60细胞和K562细胞凋亡

4 FoxM1靶向调控原癌基因bcl-2

转染FoxM1 siRNA至HL60细胞和K562细胞后，RT-qPCR和Western blot检测证实FoxM1 siRNA转染是有效的，FoxM1的mRNA和蛋白水平均明显降低。同时发现Bcl-2的mRNA和蛋白水平随之降低。这提示bcl-2可能是FoxM1的靶基因。进一步共转染bcl-2启动子质粒和FoxM1/NC siRNA及内参照pRL-TK质粒至HL60细胞和K562细胞，双萤光素酶活性检测发现干扰FoxM1表达后，bcl-2启动子活性降低。这说明FoxM1通过结合于bcl-2启动子直接靶向调控bcl-2表达，见图4。

5 急性髓系白血病初诊患者FoxM1表达与Bcl-2表达呈正相关

用RT-qPCR方法和免疫荧光技术检测14例AML-denovo患者、14例正常骨髓标本中FoxM1和Bcl-2的mRNA水平和蛋白表达。结果显示，与正常健康对照相比，AML-denovo组患者骨髓标本中FoxM1 mRNA水平显著升高，同时伴随着Bcl-2 mRNA水平显著升高，二者表达呈正相关。此外，免疫荧光结果显示，AML-denovo组患者骨髓标本中Bcl-2蛋白表达明显升高，表明Bcl-2在急性髓性白血病中表达升高，且与FoxM1表达呈正相关，见图5。

讨 论

化学治疗是急性髓系白血病的主要干预策略，但由于其在白血病细胞和正常细胞之间无选择性，因此不可避免会伤害正常细胞，引起毒副作用，因此，针对AML发生发展中关键分子为靶点的精准靶向治疗将成为AML治疗的新趋势。目前肿瘤的分子靶向治疗已取得巨大进步，如酪氨酸激酶抑制剂、CD20单抗等分子靶向药物已显示良好临床疗效。然而，AML的发生发展是一个多因素、多阶段、多步骤的过程，涉及到大量分子参与的复杂网络调控，现有的分子靶向药物难以满足临床治疗的需要[5-6]。因此，挖掘AML发生发展新的节点分子，确定其做为AML干预的潜在靶点具有十分重要的价值。

Figure 4. FoxM1 directly regulatedbcl-2 expression. A: RT-qPCR analysis of the mRNA expression of FoxM1 and Bcl-2 in the HL60 cells and K562 cells transfected withFoxM1 specific siRNA; B: the protein expression of FoxM1 and Bcl-2 in the HL60 cells and K562 cells transfected withFoxM1 specific siRNA determined by Western blot analysis; C:bcl-2 promoter activity withFoxM1 siRNA transfection in the HL60 cells and K562 cells. Luciferase activities were measured at 72 h and normalized byRenillaluciferase activity. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC siRNA.

图4 FoxM1靶向调控bcl-2表达

本研究通过对AML初诊患者、完全缓解患者、难治复发患者骨髓标本中FoxM1表达的测定，发现初诊患者FoxM1水平较正常骨髓标本明显增高，完全缓解患者下降，难治复发组FoxM1表达水平较初诊患者升高更为明显，提示FoxM1与AML发生发展及治疗效果相关。由于FoxM1在健康人骨髓标本不表达，因此，FoxM1是干预AML的潜在靶标。

FoxM1主要通过调控细胞周期相关分子转录介导细胞异常增殖，从而参与肿瘤发生[7]。新近发现FoxM1与细胞凋亡有关，如FoxM1可通过抑制蛋白激酶JNK活性发挥抗凋亡作用[8]，蛋白酶体抑制剂Bortezomib处理人肿瘤细胞系FoxM1水平下调后，促进细胞凋亡[9]。我们以白血病细胞株HL60和K562为研究对象，用FoxM1特异性siRNA转染HL60和K562细胞后，观察到白血病细胞生长受抑、凋亡增加，表明抑制AML细胞FoxM1表达，不仅可抑制白血病细胞生长，还可以促进白血病细胞凋亡。凋亡抑制分子Bcl-2是细胞凋亡研究中最受关注的癌基因之一。研究发现AML中存在Bcl-2高表达，与AML凋亡受阻、对化疗耐药相关，有IDH1和IDH1异常的AML细胞依赖Bcl-2的高表达，用Bcl-2抑制剂治疗效果好[10]。鉴于FoxM1和Bcl-2在AML中都有重要作用，为此，我们研究AML细胞中Bcl-2的表达，发现用特异性siRNA抑制FoxM1表达时Bcl-2的表达同步降低，进一步通过双萤光素酶活性检测观察到FoxM1影响bcl-2启动子活性。而在急性髓性白血病患者标本中也检测到Bcl-2的表达升高，与FoxM1表达呈正相关，表明FoxM1和Bcl-2共同参与AML的发生。因此，我们推测FoxM1通过靶向调控bcl-2的表达，抑制细胞凋亡和促进细胞增殖，从而促进AML发生发展；沉默FoxM1表达则可能靶向抑制bcl-2的表达进而干预AML发生。

Figure 5. Bcl-2 was over-expressed in AML and its expression was positively correlated with FoxM1 expression. A: the mRNA expression of FoxM1 and Bcl-2 in BM samples from the patients in different groups detected by RT-qPCR analysis; B: FoxM1 and Bcl-2 expression was positively correlated; C: the protein expression of Bcl-2 in BM samples from the patients in different groups determined by cellular immunofluorescence analysis. Mean±SD.n=14.*P<0.05vscontrol.

图5 急性髓性白血病初诊患者FoxM1表达与Bcl-2表达呈正相关

综上所述，我们的研究表明FoxM1与AML发生发展相关，沉默FoxM1可抑制bcl-2表达进而影响到白血病细胞的增殖和凋亡，此为探索基于FoxM1为靶点干预AML发生发展提供了初步依据。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

FoxM1 promotes development of AML by regulating Bcl-2 expression

CHEN Jin1, WANG Xiao-ming2, ZHOU Min-ran2, SUN Ting2, CHEN Zhong-min3, CHEN Chun-yan2

(1AnhuiMedicalCollege,Hefei230601,China;2DepartmentofHematology,QiluHospital,ShandongUniversity,Jinan250012,China;3SchoolofPharmacyandBioengineering,ChongqingUniversityofTechnology,Chongqing400054,China.E-mail:chency@sdu.edu.cn)

AIM: To investigate the role of Forkhead box M1 (FoxM1) and B-cell leukemia/lymphoma-2 (Bcl-2) in the pathogenesis of acute myeloid leukemia (AML). METHODS: RT-qPCR and immunofluorescence analysis were used to determine the expression of FoxM1 at mRNA and protein levels in AML-denovopatients, AML-complete remission (CR) patients, AML-refractoriness and relapse (RR) patients and healthy controls. HL60 cells and K562 cells were transfected withFoxM1 siRNA. The cell proliferation was detected by cell proliferation assay and colony formation assay on soft agar, and the cell apoptosis was determined by flow cytometry. The expression of FoxM1 and Bcl-2 at mRNA and protein levels was detected by RT-qPCR and Western blotting. The activity ofbcl-2 promoter was examined by luciferase reporter assay with FoxM1 targetting. RESULTS: FoxM1 expression level in the AML-denovopatients was significantly higher than that in the healthy controls. As compared with the AML-denovopatients, FoxM1 expression in the AML-CR patients was reduced, and the FoxM1 expression level was the highest in the AML-RR patients. FoxM1 expression was inhibited in the HL60 cells and K562 cells transfected withFoxM1 siRNA. Transfection withFoxM1 siRNA in the HL60 cells and K562 cells inhibited the proliferation as compared with NC siRNA transfection, and impaired the colony formation ability. On the contrary, transfection withFoxM1 siRNA promoted the cell apoptosis. FoxM1 regulatedbcl-2 expression positively. CONCLUSION: FoxM1 promotes the development of AML by regulatingbcl-2 expression. Silencing ofFoxM1 expression suppresses cell proliferation and promotes cell apoptosis. FoxM1 is a potential target for AML treatment.

Acute myeloid leukemia; Forkhead box M1; Bcl-2

1000- 4718(2016)08- 1383- 06

2016- 02- 17

2016- 07- 05

国家自然科学基金资助项目(No. 81170514)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.007

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel： 0531-82169867； E-mail： chency@sdu.edu.cn